柑橘花藥試管愈傷誘導技術

羅君琴，徐建國，王 平，柯甫志，聶振朋

(浙江省柑橘研究所，浙江 黃巖 318020)

花藥離體培養技術在作物育種和遺傳進化研究中具有重要的理論和應用價值，利用該技術可獲得一定比例的單倍體或異倍體材料，有助于在短期內創造新的不同基因型的遺傳材料，豐富作物育種原始種質資源，有助于縮短育種進程［1-11］。

本研究選擇柑橘單核中晚期花藥為離體培養外植體［7-8］，通過比較不同柑橘品種［2］、培養基外源激素配方［3，8-9，12-15］、外植體低溫預處理［3，7-8，12］等因子對花藥離體愈傷誘導的影響，研究柑橘花藥離體愈傷誘導及無菌再生體系的建立，以期為今后全面開展柑橘花藥 (花粉)離體培養奠定一定的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以浙江省柑橘研究所山地試驗站品種資源圃及本部試驗場的北京檸檬 (Citrus limon Burm.f.)、439桔橙 (reticulata× sinensis)、早桔 (Citrus compressa Tanaka)、四季桔 (madurensis Lour.)和長壽金柑(Fortunella obovata Tanaka)5個柑橘品種為試材，以柑橘現蕾期花粉處于單核中晚期時的幼花蕾花藥為離體培養對象。

1.2 外植體消毒

先將柑橘幼花蕾在洗滌劑中浸泡15～30 min，流水沖洗20～30 min，在無菌條件下，將花蕾進行75%乙醇10～15 s+0.1% 升汞10 min 滅菌處理，無菌水沖洗3～5 次后，在體視顯微鏡下切除花絲，小心切取花藥接種到各誘導培養基上，接種時注意避免花柱、花冠、子房等其他組織器官混入。

1.3 試驗設計

1.3.1 不同柑橘品種花藥離體愈傷誘導比較

試驗比較北京檸檬等5種柑橘花藥在相同培養條件下離體愈傷誘導效果。每個品種離體接種500個以上花藥，花藥接種后每隔1 周觀察愈傷形成情況，記錄各品種花藥最早愈傷出現時間，3個月后統計產生愈傷接種外植體比例。

1.3.2 外源激素對柑橘花藥愈傷誘導的影響

以MT 基本培養基中添加6-BA，TDZ，2，4-D為考查因子，利用正交設計篩選花藥愈傷誘導培養基外源激素配方。試驗以北京檸檬花藥為接種外植體，采用L9(33)正交方案，設9個處理組合，每個處理組合接種400～500個花藥，培養3個月后，觀察記錄花藥愈傷誘導情況，統計分析外源激素對花藥愈傷誘導的影響。

1.3.3 低溫預處理對柑橘花藥愈傷誘導的影響

柑橘花藥外植體接種于相同愈傷誘導培養基上，先分別在 (6 ± 2)℃低溫暗培養0，5，10，15，20 d，再轉入23～25℃條件暗培養。每處理400～500個花藥，3個月后觀察統計產生愈傷外植體比例。以上各處理基本培養基均為MT+30～40 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂，pH 值5.8，培養溫度無特指均為23～25℃，光照條件為愈傷產生前為暗培養，愈傷形成后在2 000～2 500 lx 下12 h·d-1光培養。

2 結果與分析

2.1 不同柑橘品種花藥離體愈傷誘導比較

從表1 可知，北京檸檬花藥愈傷較易誘導，花藥愈傷最初產生所需時間在5個柑橘品種中最短，5 周即肉眼可見愈傷產生，接種后花藥產生愈傷外植體比例極顯著高于其他幾種，高達69.97%。439 桔橙、長壽金柑、四季桔花藥愈傷誘導較難，花藥接種3個月后外植體愈傷比率僅分別為1.90%，0.33%和0.20%。早桔接種后3個月內未能獲得花藥愈傷，接種23 周后才有愈傷產生，其花藥愈傷誘導在5個供試品種中最難。柑橘花藥離體接種及所獲誘導愈傷的部分組培圖片如圖1所示。

表1 5個柑橘品種花藥離體愈傷誘導

2.2 不同外源激素對柑橘花藥愈傷的誘導

圖1 幾種花藥離體培養形成的愈傷組織

北京檸檬花藥離體培養3個月后，觀察比較各處理培養基對花藥愈傷誘導的影響 (表2)。對6-BA，TDZ 和2，4-D 3個水平、9個組合試驗結果進行極差分析表明，3種外源激素對花藥愈傷誘導的影響作用依次為2，4-D ＞TDZ ＞6-BA;對試驗數據進行方差分析表明，2，4-D (F=10.34)，TDZ (F=1.63)，6-BA (F=0.29)等因子對北京檸檬花藥愈傷誘導影響均未達顯著水平。結合表2直觀分析，試驗可優選處理2 組合培養基用于柑橘花藥愈傷誘導培養。

表2 外源激素對北京檸檬花藥愈傷誘導的影響

2.3 低溫預處理對柑橘花藥愈傷誘導的影響

北京檸檬、439 桔橙花藥接種前分別在 (6 ±2)℃低溫暗培養0，5，10，15，20 d，各處理花藥接種3個月后，進行外植體產生愈傷比例觀察(圖2)。

圖2 低溫預處理時間對柑橘花藥愈傷誘導的影響

由圖2 可知，2種柑橘在 (6 ±2)℃低溫預處理5～10 d，花藥外植體愈傷誘導比率均高于未低溫預處理及低溫預處理超過15 d 的處理。適當時長的低溫預處理有助于柑橘花藥離體愈傷誘導。

3 小結和討論

相同誘導培養基和光溫控制條件下，5個供試柑橘品種花藥愈傷誘導差異很大，一定程度上反映出柑橘花藥誘導受各品種不同的遺傳因子直接影響。品種選擇是柑橘花藥愈傷誘導成敗的關鍵。結合鄭振光等［8］的柑橘花藥培養研究表明，檸檬類、橙類花藥的離體愈傷誘導相對較易，寬皮柑橘類栽培品種花藥愈傷誘導較難。試驗中的長壽金柑、四季桔均是金柑與寬皮柑橘的雜種后代，兩品種的花藥離體愈傷最初產生所需時間及花藥接種3個月后的外植體愈傷比例很接近，這也反映出遺傳基因決定柑橘花藥離體愈傷誘導難易程度。

外源激素是影響花藥離體培養的關鍵因素。不同果樹對不同植物生長調節劑種類、濃度的反應不同，需在試驗中找到各自適合的組合配方。目前國內外有關柑橘花藥離體愈傷誘導技術報道相對較少，可直接借鑒的培養基配方技術參數相關資料更少。利用正交設計試驗研究柑橘花藥愈傷誘導分化培養基激素組合，可快速有效地篩選、判斷培養基添加適用外源激素種類及濃度范圍。2，4-D，TDZ和BA 是植物組培中愈傷誘導的重要添加激素［8，13，15］，細胞分裂素/生長素比值及絕對濃度 控制接種外植體的脫分化及再分化形態建成的方向，直接影響花藥外植體愈傷誘導結果。本研究通過正交試驗結果分析發現，6-BA，TDZ，2，4-D 3種生長調節劑對供試柑橘花藥離體愈傷誘導的影響主次順序為2，4-D ＞TDZ ＞6-BA，(BA+TDZ)/2，4-D 比值在3～4∶1 范圍內可較大程度地促進柑橘花藥離體愈傷誘導。更易促進柑橘花藥愈傷誘導的細胞分裂素/生長素比值是否也在該范圍內，有待進一步試驗。

柑橘花藥接種前期在 (6 ±2)℃低溫預培養5～10 d 有利于柑橘花藥離體培養后的愈傷誘導。本試驗結果與陳力耕等［7-8，12］適當時長的低溫預處理促進花藥愈傷誘導的研究結果一致。目前針對不同作物物種花藥誘導培養各實驗室所采用的低溫預處理絕對溫度不盡相同，宜根據不同低溫試驗獲取各自的適宜處理時長。試驗中還發現，不經低溫預處理的對照組檸檬花藥外植體誘導率仍可達48.1%，一定程度上說明低溫預處理非花藥愈傷誘導必不可少的決定性技術因子。低溫預處理促成愈傷組織形成，可能與其在不影響花藥內花粉正常生長前提下，延緩離體培養的花藥熟化，為花藥吸收外源激素盡快促成生殖生長向營養生長轉變有關。

目前實驗室已成功誘導獲取北京檸檬、439 桔橙、四季桔等4個柑橘品種花藥愈傷組織，并根據愈傷發生部位不同，分類繼代增殖及保存，下階段可進一步開展愈傷材料倍性檢測、胚狀體或再生芽誘導等試驗研究。

［1］張圣倉，魏安智，楊途熙.果樹單倍體和加倍單倍體(DH)技術研究與應用進展［J］.果樹學報，2011，28(5):869-874.

［2］胡齊贊，龔亞明，韋順戀，等.大白菜花藥和游離小孢子培養比較研究［J］.浙江農業學報，2007，19 (5):352-355.

［3］LI Junqiang，WANG Yongqing，LIN Lihua，et al.Embryogenesis and plant regeneration from anther culture in Loquat (Eriobotrya japonica L.)［J］.Scientia Horticulturae，2008，115:329-336.

［4］張俊娥，郭文武，鄧秀新.柑橘愈傷組織倍性變化及其與體細胞胚胎發生能力的關系［J］.遺傳學報:英文版，2006，33 (7):647-654.

［5］張潔，張學英，葛會波.果樹花藥培養研究概況［J］.河北農業大學學報，2002，25 (增刊):95—97.

［6］秦紅玫.果樹花藥培養再生植株研究進展［J］.農業科技通訊，2011 (3):33-34.

［7］陳力耕.柑橘花藥培養中提高胚狀體誘導率的研究［J］.中國農業科學，1992，25 (1):90-91.

［8］鄭振光.誘導柑橘花粉植株的研究［J］.園藝學報，1983，10 (2):73-78.

［9］李文劍，曹后男，宗成文，等.蘋果梨離體葉片再生體系的建立［J］.果樹學報，2012，29 (5):800-803.

［10］楊振英，薛光榮，蘇佳明，等.富士花藥培養選育出蘋果新品種華富［J］.園藝學報，2005，32 (1):172.

［11］GERMANA M A.Doubled haploid production in fruit crops［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，86 (2):131-146.

［12］Na H，Kim D，Chun C.Effects of cold pretreatment and medium composition on anther culture initiation in strawberry［J］.Korean Jour of Hort Sci and Tech，2011，29 (5):488-493.

［13］WANG Jing dong，ZHANG Li，MA Hong ai，et al.Application of plant growth regulator TDZ in strawberry anther culture ［J］.Agricultural Science and Technology，2010，11(9-10):82-84，90.

［14］ZHAO Ji，ZOU Xue xiao，ZHANG Zhu qing，et al.Influences of carbon sources and plant growth regulators on anther culture efficiency of pepper［J］.Agricultural Science ＆Technology，2010，11 (4):102-105.

［15］支玉璽，張劍俠，王躍進.華東葡萄廣西-2 花藥胚狀體誘導與再生植株的研究［J］.果樹學報，2010，27 (1):18-23.