盈江縣耕地土壤高效解磷菌的分離篩選研究

鐘小玉 于波 張晨光

（1河源市清潔生產中心 廣東河源 517000 2青島中一監測有限公司 山東青島 266000 3德宏州環境保護局 云南德宏 678400）

磷是農作物生長所必需的三大元素之一。土壤中全磷的含量是十分豐富的，但是可利用的有效磷含量極低，一般當季作物只能吸收5~10%的磷肥，而其中大部分的磷會固定在土壤中，以無效態磷的形式存在，尤其在暴雨沖刷、下滲、側滲情況下，磷就會進入湖泊、水庫造成水體富營養化。如何利用土壤中無效態的磷成了國內外眾多農業和環境領域學者所研究的熱點課題。

1 材料與方法

一般來說，采樣的最佳時間為晚秋或早春采集土樣，根據實驗安排采樣時間定為2012年10月23日。

1.1 培養基的制備

根據余賢美等[1]的研究結果，以有機磷液體培養基作為生物富集培養基，然后在無機磷固體培養基上進行平板稀釋法篩選，可以有效的分離篩選土壤中的解磷細菌。

無機磷細菌固體培養基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.5g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Ca3(PO4)210g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，瓊脂粉 18~20g/L，蒸餾水 1L，pH 7.0~7.5。有機磷細菌液體培養基：葡萄糖 10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO3 5.0g，（NH4）3PO40.5g，加蛋黃液10mL(蛋黃液為無菌生理鹽水與雞蛋黃1:1配制)，蒸餾水1L，pH7.0~7.5。（生理鹽水：9gNaCl溶于1L水中）。本研究中所用的試劑均為國產分析純試劑。斜面保存培養基（LB培養基）：胰化蛋白胨10g，酵母膏 5g，NaCl10g，瓊脂 20g，H2O1L。

1.2 高效解磷菌的分離與篩選

解磷菌的生物富集：稱取處理后的土樣1g加入到100mL有機磷液體培養基中，于28℃，200～250r/min條件下振蕩培養48h。

平板稀釋法分離解磷細菌：按 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的梯度進行稀釋，對最后5個稀釋梯度各取0.2mL上清液，每個稀釋度做3次重復，分別在無機磷或有機磷固體培養基平板上涂布均勻，置于28℃培養箱中培養7d，觀察平板中菌落生長情況及溶磷圈的產生。將固體培養基上長出的單菌落分別在無機磷細菌固體培養基平板上進行四分體劃線分離及純化，以獲得純菌株。并根據溶磷圈直徑與菌落直徑的比值篩選目標菌株，并把比值較大的菌株保存在斜面培養基上，放在4℃冰箱中保存備用。

1.3 水溶性磷測定方法

將純菌株從斜面接種到無機磷固體培養基上，培養7d，再將菌落刮入無菌水中，制成菌體懸浮液，濃度約為108cuf/mL。向250ml三角瓶中加入100ml無機磷液體培養基，再接入2ml菌液，同時做空白對照。28℃，轉速200~250r/min，連續培養14d，每隔24h取菌液，3000r/min離心、0.45μm濾膜過濾后，用磷鉬藍比色法測定濾液中的水溶性磷含量，連續測定14d。

2 結果與分析

2.1 解磷圈的測定結果分析

以有機磷液體培養基作為富集培養基，以無機磷固體培養基作為篩選培養基，置于28℃培養箱中培養7d，得到11株具有較大溶磷圈的細菌。根據溶磷圈直徑與菌落直徑的比值(HD/CD)大小初步確定11個菌株解磷能力的強弱。其中5株較強的解磷細菌HD/CD值詳見表1。

由表1可見，PSB23和PSB45這兩株解磷菌的HD/CD值分別為4.31和4.07，是這11株解磷菌中最大的兩株。

2.2 菌株的形態學鑒定

根據表2、表3的結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版[2]，并結合形態學觀察，PSB23和PSB45菌株初步鑒定為芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。

2.3 解磷菌溶解磷酸三鈣的結果分析

圖1 PSB23和PSB45的解磷曲線

圖1 可見，隨著時間的推延，兩待測菌株上清液扣除空白后的水溶性磷含量逐漸增加，其中PSB23上清液含磷量第9天出現峰值，水溶性磷含量為174.86mg/L；PSB45號第10天出現峰值，可溶性磷含量為156.32mg/L。出現峰值后，兩待測菌株上清液中水溶性磷含量小幅下降并趨于平衡。

3 結論

從盈江縣耕地玉米根際土壤中分離出的兩株具有較強解磷功能的菌株PSB23和PSB45經過形態學鑒定為巨大芽孢桿菌，HD/CD最大值分別為4.31和4.07在以Ca3(PO4)2為唯一磷源的無機磷液體培養基中，連續培養14d，最大溶磷量分別為174.86mg/L和156.32mg/L。

[1]余賢美,沈奇賓,李炳龍,等.土壤解磷細菌分離和篩選方法的建立[J],熱帶作物學報,2008,29(3):321-325.

[2]R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].科學出版.