丹參酸B 抗體外培養的海馬神經元OGD 損傷的作用機制研究*

羊 帆 王 玉

（浙江中醫藥大學生物工程學院，浙江 杭州 310053）

在水溶性酚酸類活性成分中含量高于50%［1］。以往的研究發現，丹酚酸B 可以明顯改善大鼠急性腦缺血再灌注所致的神經細胞損傷，改善腦缺血引起的行為障礙［2］。本實驗觀察不同的丹酚酸B 濃度對海馬神經元缺血再灌注損傷后的影響，以探討丹酚酸B 對腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物 胰蛋白酶、DMEM 高糖培養基、Neurobasal 培養液、B27 補充物、青霉素、鏈霉素（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；多聚賴氨酸（Sigma）；L-谷氨酰胺（杭州宏博進口分裝）；丹酚酸B 標準品（上海同田生物技術股份有限公司，20120912），丹紅注射液（菏澤步長制藥有限公司，批號：120411）；阿糖胞苷（上海華聯制藥廠）。

1.2 大鼠海馬神經元的分離培養 取新生24 h 內的SD 大鼠（浙江中醫藥大學動物中心提供），在無菌條件下分離出雙側海馬，用0.25%胰蛋白酶消化（37℃、20 min），加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養基以終止消化，用巴斯德管將組織塊輕輕吹散，制成密度為2×105個/cm2的單細胞懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的六孔板上，置于37℃含5%CO2的培養箱內培養。1 d 后細胞貼壁，全部吸棄DMEM 培養液，換為完全培養基。完全培養基為Neurobasal 培養液加2%B27 補充物、0.5 mM L-谷氨酰胺、1%青、鏈霉素組成。以后每周換液2次，每次換半液。于培養第4日在培養液中加入阿糖胞苷終濃度為10 μM 作用48 h 以抑制膠質細胞的過度生長。經免疫熒光鑒定，通過細胞計數器統計，90%以上的細胞均為神經元。培養第10日的神經元用于實驗。

1.3 模型制備 向無糖的人工腦脊液（ACSF）中通入95% N2/5% CO2，通氣的同時用溶氧儀測定ACSF 中溶解氧的濃度，直至將至0 附近，將原來正常的種植液置換為缺氧缺糖的ACSF 液4 h，造成神經元缺氧缺糖損傷，建立海馬神經元離體缺氧缺糖（OGD）模型。

1.4 分組與干預 取OGD 模型建立成功的神經元小皿，隨機分為：OGD 模型組（OGD 4 h 后換回原有含糖的DMEM 培養基，放回含5%CO2的培養箱內37℃繼續培養24 h）、丹酚酸B 小、中、大劑量組（OGD 4 h 后加入終濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的丹酚酸B，放回含5%CO2的培養箱內37℃繼續培養24 h）及丹紅注射液組（OGD 4 h 后加入終濃度為50 μmol/L的丹紅注射液，放回含5%CO2的培養箱內37℃繼續培養24 h）。另設空白組（加入不經缺氧缺糖處理的ACSF，37℃5% CO2的培養箱內孵育4 h 后，換回DMEM 高糖培養液，37℃、5%CO2的培養箱內繼續培養24 h）。劑量的選擇依據預試驗ED50和LD50值設定。考察丹酚酸B 對神經元抗自由基損傷的保護作用機制。每組重復3次。

1.5 標本采集與檢測 取造模前后及治療前后海馬神經元進行形態學觀察。采用四唑鹽比色法（MTT 法）測定細胞活力，各組分別取96 孔培養板的8個孔，缺糖缺氧4 h 后每孔內加入MTT（終濃度為5 g/L）20 μL，37℃溫育4 h，然后吸去各孔內的液體，每孔內再加入二甲基亞砜150μL，待沉淀物充分溶解后用酶標儀在570 nm 處測定各孔的OD 值，以代表神經元的活性。神經元存活率以正常組OD 值的均數為100%，按存活率（%）=各孔OD 值/正常組OD 值均數×100%計算。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的含量，細胞上清液的取樣量為0.1 mL，檢測按試劑盒說明書操作，重復3次；采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定MDA的含量，細胞上清液的取樣量為0.1 mL，檢測按試劑盒說明書操作，重復3次。

1.6 統計學處理 應用SPSS16.0 統計軟件。計量資料以表示，采用單因素方差分析、LSD的多重比較方法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OGD 誘導后對海馬神經元形態學的影響 新生大鼠海馬神經元分散培養10 d，神經元胞體增大，有明顯的折光性，立體感強，多數呈錐體狀或多極性，神經突起相互聯絡成網，細胞已具有成熟神經元的形態學特點［3-5］。經OGD 誘導，電鏡觀察部分神經元胞體出現腫脹，胞體增大，少數神經元胞體出現空泡，突起淡化、解離，神經元纖維呈簇狀。

2.2 細胞的存活率測定 見表1。細胞進過缺氧缺血后細胞的存活率明顯下降，在進行丹酚酸B 給藥后，細胞存活率有所提高，中劑量的丹酚酸B 效果最佳（P＜0.05）。

表1 各組細胞存活率比較（%，±s）

表1 各組細胞存活率比較（%，±s）

與空白組相比，*P＜0.05；與OGD 模型組相比，△P＜0.05。下同。

2.3 SOD 活性與MDA 含量的測定 OGD 模型組中SOD 活性下降，MDA 含量增加；丹酚酸B 組SOD 活性升高，MDA 含量降低，中劑量組效果最佳（P＜0.05）。

表2 各組細胞上清液中SOD 活性與MDA 含量比較（±s）

表2 各組細胞上清液中SOD 活性與MDA 含量比較（±s）

3 討論

丹參具有活血祛瘀、養血安神、涼血消腫等功效。丹酚酸是丹參中重要的水溶性有效成分，種類較多，其中丹酚酸B 含量較多，在腦缺血再灌注損傷中功效顯著。腦缺血再灌注過程中出現大量氧自由基是神經元級聯死亡的重要原因。正常情況下體內自由基的產生和消除處于動態平衡狀態故不發生自由基連鎖反應和組織損傷。氧自由基和超氧自由基產生增多，會引起細胞功能紊亂，超氧化物歧化酶（SOD）活力下降，腦組織細胞生成大量的丙二醛（MDA）。本實驗利用體外培養的海馬神經元建立OGD 模型，體外模擬腦缺血缺氧再灌注損傷模型，檢測SOD 活力與MDA 含量。結果提示，丹酚酸B 可明顯提高SOD 活性和降低MDA 含量，且中劑量組的效果最優，說明丹酚酸B 在腦缺血缺氧再灌注損傷中有明顯的保護作用。

［1］鐘靜，唐民科，張妍，等.丹酚酸B 對腦缺血再灌注大鼠神經細胞損傷和神經發生的影響［J］.藥學學報，2007，42（7）：716-721.

［2］Chen YH，Du GH，Zhang JT.Salvianolic acid B protects brain against injuries caused by ischemia-reperfusion in rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，21（11）：81-84.

［3］Beh IC，Lezoualch F，Trapp T，et al.Glucocorticoids enhanceoxid ative stress induced cell death in hippocampal neuronsin vitro［J］.Endocrinology，2009，138（1）：101-106.

［4］Kiryushko D，Kofoed T，Skladchikova G，et al.A synthetic peptide ligand of neural cell adhesionmolecule（NCAM）.C3d promotes neurito-genesis and synaptogenesis and modulates presynaptic function inprimary cultures of rat hippocampal neurons［J］.J Biol Chem，2010，278（6）：12325-12334.

［5］Ikegaya Y，Itsukaichi-Nishida Y，Ishihara M，et al.Distance of target search of isolated rat hippocampal neuron is about 150 microm［J］.Neuroscience，2010，97（2）：215-217.