益氣活血方對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的干預(yù)作用

黃太權(quán) 易春濤△ 褚怡雯 湯慶豐 付如珍 周 寧

（1.上海市徐匯區(qū)康健街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200233；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062；3.上海市靜安區(qū)曹家渡街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200042）

益氣活血方是根據(jù)氣虛是中風(fēng)致病的根源，血瘀是中風(fēng)發(fā)生發(fā)展的核心的病理性質(zhì)而擬定的治療急性腦梗死的常用方［1-3］，是經(jīng)過多年臨床總結(jié)篩選治療急性腦梗死的有效處方，在臨床運(yùn)用過程中取得了良好的臨床效果。本研究旨在通過神經(jīng)功能缺損評分，腦組織形態(tài)學(xué)觀察，含水量測定，ATP 酶、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶活性，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量測定，探索益氣活血方對腦缺血再灌注損傷作用機(jī)制，為臨床提供依據(jù)，從而為臨床腦保護(hù)藥物的研制和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 益氣活血湯藥（黨參15 g，黃芪30 g，赤芍10 g，川芎10 g，紅花6 g，桃仁10 g，三棱10 g，莪術(shù)10 g，地龍3 g，全蝎6 g）由普陀區(qū)中心醫(yī)院中藥房制作。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康Sprague-Dawley 大鼠，雌雄各半，10 周左右，體質(zhì)量（250±10）g，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 分組與造模 觀察大鼠共48 只，隨機(jī)分為3 組，即假手術(shù)組，模型組，益氣活血組。每組16 只。除假手術(shù)組不插線外，其余兩組制備大鼠大腦中動脈阻斷缺血再灌注模型（MACO）。前兩組于術(shù)前7 d 和術(shù)后24 h按1 mL/100 g，每日2次灌喂0.9%氯化鈉注射液，益氣活血組按等劑量灌喂益氣活血湯藥（含生藥1.1 g/mL）。參考楊氏改進(jìn)的Zea longa 方法，制備大鼠大腦中動脈阻斷缺血再灌注模型。用設(shè)計(jì)30 mm 長、直徑為0.19 mm的Blue-Monofilament Nylon，（4-0 DERMALON由DG 公司生產(chǎn)），一端0.5 mm 處加熱成球形（直徑0.244 mm，0.9%氯化鈉注射液沖洗），并于距線球18 mm 處作標(biāo)記，置1%的肝素鈉溶液內(nèi)備用。用10%的水合氯醛腹腔麻醉（35 mg/100 g 體質(zhì)量），仰臥于手術(shù)臺上，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈（CCA），頸外動脈（ECA），頸內(nèi)動脈（ICA），用電凝器燒灼ECA的分支，結(jié)扎并游離ECA 主干一段，沿ICA 向下分離翼顎動脈（PPA），并沿起點(diǎn)電凝，在ECA 剪一小口注入0.03 mL 濃度為2.4×106U/L的肝素鈉溶液，將制備好的線插入ECA，經(jīng)CCA 分叉通過ICA 入顱腦至大腦中動脈（ACA），插入深度為（18.0±0.5）mm，即可遇到輕微的阻力，表明尼龍線頭端已到達(dá)（ACA）。再灌注時外拉線使球端回至ECA，拔除插線，結(jié)扎ECA 即可。假手術(shù)組不插線外，其余步驟同上。大鼠大腦中動脈栓塞后30 min 恢復(fù)血供，術(shù)后約1 h 大鼠蘇醒，出現(xiàn)右前肢屈曲和前進(jìn)時向右側(cè)劃圈，證明左側(cè)大腦中動脈阻塞成功；用2%溴化三苯四氮唑（TTC）染色以證實(shí)腦缺血灶的存在。然后保溫常規(guī)飼養(yǎng)，缺血再灌注不同時間點(diǎn)各組大鼠在規(guī)定的時間點(diǎn)取腦備用，假手術(shù)組缺血再灌注24 h 取材。實(shí)驗(yàn)過程中，因麻醉意外、MCAO 手術(shù)失敗、造模不成功及24 h 內(nèi)死亡的均棄去不用。

1.4 觀察指標(biāo)（1）神經(jīng)功能缺損積分。參考Zea Longa的5 分制評分標(biāo)準(zhǔn)［4］。各組造模成功的大鼠分別于再灌注后1、3、6、24 h 進(jìn)行評分。0 分為無神經(jīng)損傷癥狀；1 分為不能完全伸展對側(cè)前肢；2 分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4 分為不能自發(fā)行走，意識喪失。（2）腦組織形態(tài)學(xué)觀察。運(yùn)用透射電鏡進(jìn)行腦組織結(jié)構(gòu)觀察。（3）腦含水量測定。各組造模成功的大鼠，再灌注24 h 斷頭處死，取視交叉后厚約1 mm的組織，稱重后，置95℃烘烤箱內(nèi)烘烤24 h 稱干重，按GOTOH 公式：腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。（4）腦組織中SOD 活性、MDA、NO 含量測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。治療前后比較用配對資料t 檢驗(yàn)。組間比較用兩樣本的t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度積分比較 見表1。連續(xù)觀察第1 h、3 h、6 h、24 h 大鼠神經(jīng)功能評分。與假手術(shù)比較，模型組，益氣活血組均在4個時間出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損（P＜0.01）。與模型組相比，在缺血再灌注后3 h，6 h，益氣活血組積分明顯降低（P＜0.05）。在24 h時益氣活血組的積分較模型組為低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度積分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度積分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05。下同。

2.2 益氣活血方對大鼠腦組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響假手術(shù)組可見微血管切面呈橢圓，管腔無狹窄，基膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹，表面光滑，管周無水腫，海馬神經(jīng)元未見明顯改變。益氣活血組管腔形態(tài)基本正常，神經(jīng)元細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞核仁形態(tài)基本正常，核膜少有切跡、扭曲，偶有線粒體擴(kuò)張，嵴斷裂。少有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹扭曲，排列比較整齊。模型組管腔變形，內(nèi)皮細(xì)胞部分腫脹，基膜欠完整，管周有水腫、空泡現(xiàn)象。

2.3 益氣活血方對大鼠腦含水量的影響 見表2。與假手術(shù)相比，模型組患側(cè)腦含水量明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比益氣活血組腦含水量明顯下降（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腦組織中SOD 活性、MDA 含量比較見表3。與假手術(shù)相比，模型組的SOD 活性明顯下降，MDA 含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，益氣活血組SOD 活力有所升高（P＜0.05），MDA 含量有所下降，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦含水量變化的影響（%，±s）

表2 各組大鼠腦含水量變化的影響（%，±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05。下同。

表3 各組大鼠腦組織中SOD 活性、丙二醛MDA 含量比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織中SOD 活性、丙二醛MDA 含量比較（±s）

2.5 各組大鼠腦組織中NOS 活性、NO 含量比較 見表4。與假手術(shù)相比，模型組的NOS 活性無明顯變化（P＞0.05），NO 含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，益氣活血組NOS 活性明顯降低（P＜0.05），NO 含量有所下降，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腦組織中NOS 活性、NO 含量比較（μmol/g，±s）

表4 各組大鼠腦組織中NOS 活性、NO 含量比較（μmol/g，±s）

3 討論

益氣活血方能夠明顯改善大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能損傷。其涉及的機(jī)制可能是多方面的。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究可能有以下幾個方面。腦含水量是反映腦水腫的一個常用指標(biāo)［5］。缺血再灌注后的腦水腫是臨床引起死亡的常見原因之一。腦水腫不但引起腦組織體積增大，顏色蒼白，腦溝變淺等大體形態(tài)學(xué)的改變，而且鏡下也能夠見到細(xì)胞腫脹，間隙減少。這些細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化可影響腦的微循環(huán)，使得內(nèi)皮細(xì)胞，能量代謝，離子代謝等失去平衡，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡而影響神經(jīng)功能。腦缺血再灌注后的病理生理是一個多環(huán)節(jié)多因素、多途徑損傷的級聯(lián)反應(yīng)。其中自由基參與的缺血再灌注損傷，既是神經(jīng)元損傷的致命因素，又是損傷級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為氧自由基介導(dǎo)的連鎖反應(yīng)是神經(jīng)功能損傷的主要原因，也是缺血再灌注損傷的主要機(jī)制［6-8］。自由基主要攻擊脂質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸的多個不飽和鏈，使之發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致質(zhì)膜損傷，通透性增加，各種細(xì)胞器解體，加重細(xì)胞毒性水腫［9］；MDA 作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化間接地反應(yīng)了腦組織中氧自由基含量的變化；SOD 是一種帶負(fù)電荷的金屬蛋白酶，可通過歧化的方式清除超氧陰離子自由基，腦缺血及再灌時產(chǎn)生過多的自由基，消耗了大量的SOD，導(dǎo)致腦組織中含量下降［10-11］。因此可以通過測定MDA、SOD 變化，間接的反應(yīng)腦組織中自由基含量及腦組織損傷程度［12］。益氣活血組SOD 活力有所升高，MDA 含量有所下降兩組之間有顯著差異。

NO 是一種自由性質(zhì)的氣體，為較小的生物活性分子，可自由穿過細(xì)胞膜，作用于細(xì)胞內(nèi)的靶分子。在生物體內(nèi)，NO 生成后很快被氧化，以硝酸根和亞硝酸根的形式存在于細(xì)胞的內(nèi)外液中，使NO 失去生物學(xué)活性。低濃度的NO 能使血管擴(kuò)張，抑制血小板集聚與黏附，使谷氨酸調(diào)控的離子通道下調(diào)，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，因而對細(xì)胞有保護(hù)作用；但在高濃度下，NO 可與超氧陰離子反應(yīng)生成超氧亞硝酸根離子，超氧亞硝酸根離子可以降解為OH-和NO2-自由基，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，在細(xì)胞的膜水平造成強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元死亡等。研究表明NO 在腦缺血性損傷的發(fā)病中起重要作用，缺血后數(shù)分鐘NO 含量明顯增高，之后緩慢下降，于再灌注期NO 再次升高［13］。與模型組相比，益氣活血組NOS 活性明顯降低，NO 含量有所下降兩組之間有顯著差異。

因此認(rèn)為，益氣活血方保護(hù)腦缺血再灌注損傷作用可能與其能對抗自由基毒性，減輕自由基對內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷密切相關(guān)。其可能的機(jī)制筆者將在今后的研究中將作進(jìn)一步深入探討。

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