抗抑郁新化合物SIPI-C和SIPI-F對PC12細胞內游離鈣離子濃度的影響

周 慧，汪溪潔，翁志潔，李建其，馬 璟

(1.上海醫藥工業研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203;2.上海醫藥工業研究院化學制藥新技術中心，上海 200040)

SIPI-A～SIPI-F是根據藥物作用靶點，定向設計和合成的系列新型抗抑郁化合物，屬于芳烷醇哌嗪衍生物[1]，6個化合物分別為同一化學結構的不同光學異構體，其結構式見圖1。體外研究表明，6個化合物對去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、5-羥色胺(serotonin，5-HT)和多巴胺(dopamine，DA)均有較強的再攝取抑制作用，在小鼠體內表現出顯著的抗抑郁作用[2]。在進行6個化合物的成藥性比較研究時發現，SIPI-C和SIPI-F組有小鼠出現四肢抽搐等毒性反應(未發表的數據)，推測它們可能具有神經系統的副作用，其他4個化合物未出現該毒性反應。因此，對化合物SIPI-C和SIPI-F產生神經毒性反應的機制進行研究。

Fig.1 Core structure of SIPI-A －SIPI-F.SIPI-A is erythro form racemic;SIPI-B is(1R，2S)-optical isomer;SIPI-C is(1R，2R)-optical isomer;SIPI-D is(1S，2R)-optical isomer;SIPI-E is(1S，2S)-optical isomer;and SIPI-F is threo form racemic.

細胞內鈣離子濃度的增高是許多生理病理性過程的一個關鍵信號，神經細胞內的鈣離子超載是造成神經元損傷的主要原因之一[3]。Shimizu 等[4]發現，米帕明(imipramine)和米安色林(mianserin)等通過促進細胞內鈣離子釋放，濃度依賴性地增加大鼠額皮質原代培養神經元內鈣離子濃度;Joshi等[5]發現，高濃度的阿米替林(amitriptyline)和地昔帕明(desipramine)可以增加神經內分泌細胞PC12細胞和人腦星形成膠質細胞瘤U-87 MG細胞內的鈣離子濃度。在這兩個實驗中，藥物引起細胞內鈣離子濃度升高的劑量遠高于其治療劑量，對其藥效學作用的產生意義不大。因此，米帕明、米安色林、阿米替林和地昔帕明對細胞內鈣離子的作用可能與其神經系統不良反應相關。

研究發現，SIPI-C和SIPI-F抑制未分化PC12細胞中的延遲整流鉀電流的 IC50分別為0.6和1.2 μmo·lL－1，在該濃度條件下，SIPI-C和SIPI-F可以使神經細胞持續去極化，從而增加神經遞質的釋放和神經細胞的興奮性[6]。抑制延遲整流鉀通道可以延緩動作電位的復極化過程，從而使進入細胞的游離鈣離子增多。本研究應用激光共聚焦顯微鏡觀察PC12細胞給予SIPI-C和SIPI-F后，細胞內游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的動態變化，研究這兩種化合物對細胞內([Ca2+]i)的影響，以探討其可能的神經毒性作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及主要儀器

抗抑郁化合物SIPI-A，B，C和F由上海醫藥工業研究院提供，純度分別為98.53%，98.36%，99.65%和99.25%。將SIPI-A，B，C和F用二甲亞砜(DMSO)溶解，配制成終濃度為10 mmol·L－1的母液，于－20℃保存，實驗時超純水稀釋到所需濃度。青霉素/鏈霉素，硝苯地平和膠原Ⅰ型均購自Sigma公司;Hank液，D-Hank液，胰蛋白酶，DMEM/F12培養基，胎牛血清和馬血清均購自Gibco公司;DMSO為國產分析純;鈣離子熒光探針(Fluo-3/AM)購自Molecular Probe公司。激光掃描共聚焦顯微鏡LSM-510德國Zeiss產品。

1.2 細胞培養

PC12細胞(購自中科院上海生命科學研究院細胞庫)，置于含有10%馬血清、5%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1和鏈霉素 100 mg·L－1的 DMEM/F12培養基中，接種于經膠原Ⅰ型包被的培養皿，置CO2培養箱(37℃，5%CO2)中培養過夜。

1.3 實驗分組

將Hank液和D-Hank液分別作為有鈣組和無鈣組的細胞外液，根據細胞外液有鈣或無鈣以及加入藥物的不同，將實驗分為以下幾部分:①有鈣外液中，SIPI-A，B，C 和 F 10 μmol·L－1對 PC12 細胞[Ca2+]i的影響;② 有鈣外液中，SIPI-C和SIPI-F 1，10 和 100 μmol·L－1對 PC12 細 胞[Ca2+]i的影響;③ 有鈣外液中，同時加入硝苯地平和 SIPI-C 或SIPI-F，觀察硝苯地平 10 μmol·L－1對SIPI-C和SIPI-F 10 μmo·lL－1作用的影響;④ 無鈣外液中SIPI-C和 SIPI-F 10 μmol·L－1對 PC12 細胞[Ca2+]i的影響。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測[Ca2+]i的動態變化

待PC12細胞貼壁后，加入熒光離子探針Fluo-3/AM，終濃度為 10 μmol·L－1，在 37℃避光孵育40～50 min。將細胞用 Hank液(有鈣組)或D-Hank液(無鈣組)輕輕沖洗3次，然后加入1 ml相應細胞外液。激光掃描共聚焦顯微鏡采用激發光488 nm，發射光505～550 nm，連續掃描600次，掃描速率為2 s/次。各組開始連續掃描約50次后加入相應藥物，繼續掃描，掃描速率為2 s/次，觀察熒光強度的動態變化，并用ZEISS-SP2工作軟件計算出每次鈣離子的熒光強度。以各時間點的熒光強度與初始熒光強度的比值作為[Ca2+]i的相對值。

2 結果

2.1 有鈣細胞外液條件下SIPI-A，B，C和F對PC12細胞內游離鈣離子濃度的影響

圖2結果顯示，給予DMSO前后的熒光強度相對值分別為0.96±0.01 和0.92±0.13，提示實驗濃度的DMSO對[Ca2+]i無明顯影響。給予SIPI-A 10 μmo·lL－1后的相對熒光強度降低(14±7)%(n=5，P＜0.01)，提示 SIPI-A 使[Ca2+]i減少。給予 SIPI-B，SIPI-C 和 SIPI-F 10 μmol·L－1后的相對熒光強度升高(27±14)%(n=5，P＜0.05)，(84±9)%(n=5，P＜0.05)和(87±17)%(n=6，P＜0.01)，給藥后熒光強度增加，提示 SIPI-B，SIPI-C和 SIPI-F使[Ca2+]i增加。

Fig.2 Effect of SIPI-A，B，C and F on[Ca2+]iof PC12 cells in Hank's solution.SIPI-A，B，C and F 10 μmol·L －1 were added after successive scanning for 50 times，respectively.The fluorescence intensity at each time point was compared with the basal level before SIPI-A，B，C or F stimulation.The ratio was considered the relative value of [Ca2+]i.±s，n=5 － 6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the corresponding before dosing group.

2.2 SIPI-C和SIPI-F對PC12細胞[Ca2+]i的影響

2.2.1 有鈣細胞外液

圖3結果顯示，與給藥前相比，SIPI-C 1，10和100 μmol·L－1作用 100 s 后的相對熒光強度分別升高(10±9)%(n=8，P＜0.05)，(74±39)%(n=5，P＜0.05)和(91±39)%(n=7，P＜0.01)，說明[Ca2+]i顯著增加，并且隨著藥物濃度的增加，SIPI-C對[Ca2+]i的影響逐漸增加。與給藥前相比，SIPI-F 1 μmol·L－1作用 100 s 對[Ca2+]i無顯著影響，SIPI-F 10 和100 μmol·L－1作用100 s 后，相對熒光強度分別升高(55±14)%(n=6，P＜0.01)和(173±10)%(n=16，P＜0.01)，說明[Ca2+]i顯著增加，并且隨著藥物濃度的增加，SIPI-F對[Ca2+]i的影響逐漸增加。圖4結果顯示，硝苯地平10 μmol·L－1使PC12細胞熒光強度下降，給藥后相對熒光強度降低(20±11)%(n=5，P＜0.05)，提示[Ca2+]i減少。同時給予SIPI-C和硝苯地平或SIPI-F和硝苯地平，PC12細胞熒光強度立即上升達到峰值，隨后下降。給予SIPI-C和硝苯地平后的相對熒光強度升高(24±6)%(n=6，P＜0.05);給予SIPI-F和硝苯地平后的相對熒光強度升高(15±14)%(n=6，P＜0.05)。

Fig.3 Effect of SIPI-C(A1，A2)and SIPI-F(B1，B2)on [Ca2+]iof PC12 cells.±s，n=5 －8.＊＊P＜0.01，compared with the corresponding before dosing group;##P＜0.01，compared with 1 μmol·L－1group;△△P＜0.01，compared with 10 μmo·lL－1group.

Fig.4 Effects of combination of SIPI-C(A)or SIPI-F(B)10 μ mol·L －1with nifedipine 10 μ mol·L －1on [Ca2+]iof PC12 cells.

2.2.2 無鈣細胞外液

給予 SIPI-C 或 SIPI-F 10 μmol·L－1后，熒光強度立即升高達到峰值，幅度較在Hank液中明顯減小(圖5)，給藥后相對熒光強度升高(16±33)%和(18±9)%(n=5，P＜0.01)，隨后熒光強度回到靜息水平。提示在D-Hank液中，SIPI-C或SIPI-F對[Ca2+]i的影響較小。

Fig.5 Effect of SIPI-C(A)and SIPI-F(B)10 μ mol·L －1 on[Ca2+]iof PC12 cells in D-Hank's solution.

3 討論

本研究發現，在Hank液中，SIPI-C和 SIPI-F均可使[Ca2+]i增加，SIPI-A 使[Ca2+]i下降，SIPI-B使[Ca2+]i增加。因此，推測 SIPI-C和SIPI-F引起的[Ca2+]i升高可能與其神經毒性反應密切相關。因長時間的胞內鈣離子急劇增多最終導致神經細胞膜的通透性增高，細胞腫脹損傷[7]，神經細胞內的鈣離子超載是造成神經元損傷的主要原因。

未分化PC12細胞的鈣通道主要由L型鈣通道組成，只表達小部分的N型鈣通道[8]。有文獻報道，L型鈣通道參與抗抑郁藥舍曲林和馬普替林等引起的[Ca2+]i升高[9－10]。研究發現，硝苯地平10 μmol·L－1可以完全抑制 PC12 細胞 L 型鈣離子通道[11－12]。本研究結果顯示，硝苯地平 10 μmol·L－1明顯抑制SIPI-C和SIPI-F引起的細胞外鈣離子內流，說明L型鈣離子通道在SIPI-C和SIPI-F引起的反應中發揮重要作用。同時硝苯地平未完全阻斷PC12細胞[Ca2+]i增加，表明細胞膜上其他類型鈣離子通道或細胞內鈣庫釋放可能參與SIPI-C和SIPI-F引起[Ca2+]i升高。本研究發現，在D-Hank液中，給予 SIPI-C或 SIPI-F后，[Ca2+]i略有增加。與在Hank液中相比，藥物作用后[Ca2+]i增加的幅度明顯下降，提示細胞外鈣離子內流和細胞內鈣庫釋放可能同時作用引起[Ca2+]i升高。

小鼠急性毒性實驗中(未發表的數據)，SIPI-C和SIPI-F產生抽搐毒性反應的劑量分別為1600和800 mg·kg－1，根據體表面積折算相當于大鼠800和400 mg·kg－1。動物體內藥代動力學研究結果顯示，大鼠灌胃給予SIPI-C和SIPI-F 25 mg·kg－1后，最大血藥濃度分別為 0.59 和 0.70 μmol·L－1。采用腦突觸體對單胺類神經遞質再攝取的方法研究發現，SIPI-C和SIPI-F抑制5-HT，NE和DA再攝取的 IC50平均值分別為 1.67 和 0.76 μmol·L－1。在本研究中，1 μmo·lL－1的SIPI-C或SIPI-F對[Ca2+]i影響較小或無影響，10 μmol·L－1的 SIPIC或SIPI-F對[Ca2+]i有明顯影響，此濃度高于SIPI-C或SIPI-F的藥效學劑量。因此，給予SIPI-C或SIPI-F后，[Ca2+]i的變化可能并不參與其抗抑郁作用的發揮，而與其神經系統不良反應密切相關。

前期研究發現，SIPI-C和SIPI-F抑制未分化PC12細胞中的延遲整流鉀電流(半數有效抑制濃度分別為0.64 和 12.05 μmol·L－1)，使神經細胞持續去極化[6]。當細胞去極化達到一定的水平時，就會激活細胞膜電壓依賴性鈣離子通道，從而使細胞外的鈣離子向細胞內流動。細胞外鈣離子進入細胞內可以引起細胞內的鈣庫釋放，細胞內鈣庫主要有內質網、肌漿網以及線粒體等，分別受1，4，5-三磷酸肌醇受體系統[14]和 RyR 系統調控[15]。SIPI-C 和SIPI-F引起的細胞內鈣庫釋放的機制尚有待于進一步研究。

綜上所述，抗抑郁化合物SIPI-C和SIPI-F可以引起[Ca2+]i顯著增加，最終造成神經元損傷，推測SIPI-C和SIPI-F對神經細胞內[Ca2+]i的影響可能是引起神經系統的不良反應的機制之一。

[1]He XD，Jiang D，Chen C，Chu YQ，Ding CF，Weng ZJ，et al.Non-covalent complexes of the antidepressant compound SIPI5358 with cyclodextrins[J].Acta Phys Chim Sin(物理化學學報)，2010，26(10):2604-2612

[2]Li JQ，Huang LY，Dong WX，Weng ZJ，Jin H，Ni XL，et al.Synthesis and antidepressant activities of aryl alkanol piperazine derivatives[J].Chin J Med Chem(中國藥物化學雜志)，2006，16(5):270-276.

[3]Rothman SM，Olney JW.Excitotoxicity and the NMDA receptor-still lethal after eight years[J].Trends Neurosci，1995，18(2):57-58.

[4]Shimizu M，Nishida A，Hayakawa H，Yamawaki S.Ca2+release from inositol 1，4，5-trisphosphate-sensitive Ca2+store by antidepressant drugs in cultured neurons of rat frontal cortex[J].J Neurochem，1993，60(2):595-601.

[5]Joshi PG，Singh A，Ravichandra B.High concentrations of tricyclic antidepressants increase intracellular Ca2+in cultured neural cells[J].Neurochem Res，1999，24(3):391-398.

[6]Zhou H，Wang XJ，Weng ZJ，Ma J，Li JQ.Inhibition of(1R，2R)-SIPI5358 and SIPI5358 on delayed rectifier potassium current in undifferentiated PC12 cells[J].Chin J Pharm(中國醫藥工業雜志)，2012，43(6):443-447.

[7]Xiong H，Liang WL，Wu XR.Pathophysiological alterations in cultured astrocytes exposed to hypoxia/reoxygenation[J].Prog Physiol Sci(生理科學進展)，2000，31(3):217-221.

[8]Andrade A，de León MB，Hernández-Hernández O，Cisneros B，Felix R.Myotonic dystrophy CTG repeat expansion alters Ca2+channel functional expression in PC12 cells[J].FEBS Lett，2007，581(23):4430-4438.

[9]Huang CJ，Kuo DH，Chang KH，Shieh P，Chen FA，Fang YC，et al.Effect of the antidepressant sertraline on Ca2+fluxes in Madin-Darby canine renal tubular cells[J].Recept Signal Transduct Res，2009，29(6):342-348.

[10]Hsu SS，Chen WC，Lo YK，Cheng JS，Yeh JH，Cheng HH，et al.Effect of maprotiline on Ca2+movement in human neuroblastoma cells[J].Life Sci，2004，75(9):1105-1112.

[11]Nowycky MC，Fox AP，Tsien RW.Three types of neuronal calcium channel with different calcium agonist sensitivity[J].Nature，1985，316(6027):440-443.

[12]Grantham CJ，Main MJ，Cannell MB.Fluspirilene block of N-type calcium current in NGF-differentiated PC12 cells[J].Br J Pharmacol，1994，111(2):483-488.

[13]Fill M， Copello JA. Ryanodine receptor calcium release channels[J].Physiol Rev，2002，82(4):893-922.

[14]Foskett JK，White C，Cheung KH，Mak DO.Inositol trisphosphate receptor Ca2+release channels[J].Physiol Rev，2007，87(2):593-658.