法舒地爾對高糖誘導人腎小管上皮細胞轉分化的影響

倪連松，顧玲佳，高 倩

（1.溫州醫學院附屬第一醫院內分泌科，浙江 溫州 325000；2.臺州市第一人民醫院內分泌科，浙江 臺州318020；3.紹興市第六人民醫院內分科，浙江 紹興 312000）

糖尿病性腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的并發癥之一，也是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一。DN的發病機制目前尚未完全闡明。越來越多的研究表明，與糖尿病性腎小球病變相比，腎小管間質病變的嚴重程度與蛋白尿排泄量和腎功能的進行性下降有著更為緊密的聯系［1－2］。研究表明，腎間質纖維化在DN的發生發展中占有重要地位，而腎小管上皮細胞－肌成纖維細胞轉分化（epithelial－myofibroblast transdifferentiation，EMT）是腎間質纖維化的重要機制［3］。

近年來，隨著對Rho A／Rho相關卷曲螺旋形成蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶（Rho A／Rho－associated coiledcoil for ming protein serine／threonine kinase，Rho A／ROCK）信號通路研究的加深，該信號通路在EMT中的作用引起了人們的高度重視［4－5］。Rho A是Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一，在GTP結合激活態和與GDP結合失活態之間相互轉換，發揮其生理功能。ROCK，又稱Rho激酶，是Rho A下游的主要效應因子。腎中Rho A／ROCK信號通路具有重要的功能，介導了腎小管細胞、系膜細胞和足細胞的細胞支架的重構；促成了上皮細胞間質轉分化，因而在腎纖維化中起著重要的作用［6］。

目前已發現的ROCK抑制劑有十余種，其中以法舒地爾（fasudil）和Y27632的使用最廣泛，可以擴張血管，降低內皮細胞的張力，改善腦組織微循環，同時可拮抗炎性因子、保護神經、抗細胞凋亡并促進神經再生等［7］。法舒地爾是唯一用于臨床的ROCK選擇性抑制劑，目前主要用于多種原因引起的缺血性腦血管疾病的防治。法舒地爾對DN的治療作用已經在多種糖尿病動物模型中得到證實，可以減少尿蛋白，減少腎小球系膜外基質堆積，減輕腎小球硬化和腎間質纖維化等［8－11］。但是有關法舒地爾對高糖誘導的腎小管EMT影響的研究還鮮見報道。

為進一步探究法舒地爾對DN的治療作用機制，本研究以高糖培養HK－2細胞觀察高糖培養所誘導的EMT現象，并用不同濃度法舒地爾進行干預，探討法舒地爾對高糖培養腎小管EMT的影響，同時檢測其對結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

HK－2細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，編號：GDC152。鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業股份有限公司（產品批號：091114）；DMEM培養液和胎牛血清購自美國Gibco公司；鼠抗人E－鈣黏素、波形蛋白、CTGF、α－平滑肌肌動蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、ROCK 抗體及羊抗人磷酸化－肌球蛋白磷酸酶目標亞單位1－蘇氨酸696（p－MYPT1－Thr696）購自美國 Santa Cruz公司；兔抗人p－MYPT1－Thr853購自美國Cell Signaling公司；FITC標記羊抗大鼠Ig G抗體購于聯科生物公司；免疫共沉淀試劑盒、辣根過氧化物酶標記二抗購自江蘇省碧云天生物技術研究所。酶標儀：美國Ther mo公司；Imaglab凝膠成像系統：美國Bio－Rad公司。

1.2 HK－2細胞培養和分組

HK－2細胞常規培養在含10%胎牛血清、青霉素100 k U·L－1和鏈霉素100 k U·L－1的低糖（5.5 mmol·L－1D－葡萄糖）DMEM 培養液中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，2～3 d換液1次。為了誘導EMT，HK－2細胞在高糖（60 mmol·L－1）條件下培養72 h，該葡萄糖濃度選擇參考預實驗結果，時間選擇參考文獻［12－13］。

將HK－2細胞分為6組：正常對照組（葡萄糖5.5 mmol·L－1），高張組（葡萄糖5.5 mmol·L－1＋甘露醇54.5 mmol·L－1），高糖組（葡萄糖60 mmol·L－1），高糖＋法舒地爾5，10和20μmol·L－1組。

1.3 免疫共沉淀法檢測HK－2細胞ROCK活性

HK－2細胞接種在10 c m細胞培養皿中，細胞培養貼壁生長至100%融合，更換為無血清培養液同步培養24 h，用含葡萄糖60 mmol·L－1的高糖培養液干預，分別于0，30 min和1，3，7，12和24 h收集細 胞［12］，裂解細胞后，收集裂解液于4℃，17 949×g離心30 min，收集上清，取50μl上清用于檢測總ROCK的表達并作為內參照，余上清加入10μl p－MYPT1－Thr696或10μl p－MYPT1－Thr853一抗，4℃搖床過夜，再加入充分混勻的蛋白A＋G瓊脂糖4℃搖床2 h以沉淀免疫復合物，用預冷的PBS洗滌沉淀3次，完成最后一次洗滌后，去除上清，加入1×SDS－PAGE電泳上樣緩沖液。變性后取50μl進行10%SDS－PAGE電泳，Western蛋白質 印 跡 法 檢 測 p－MYPT1－Thr696 和 p－MYPT1－Thr853的表達，用I magelab軟件分析結果，以所測得的各條帶的積分吸光度（integrated absor bance，IA）與相應總ROCK的IA的比值表示ROCK活性。

1.4 免疫熒光細胞化學法檢測α－SMA的表達

HK－2細胞以每孔5×104細胞接種在置有爬片的24孔板內，細胞培養貼壁生長至70%融合后，更換為無血清培養液同步培養24 h，按實驗分組換為不同培養液（1 ml），于72 h收集細胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定和0.1%Triton X－100溶液穿孔細胞后用10%正常羊血清37℃封閉1 h，滴加一抗（1∶100大鼠抗人α－SMA 抗體），4℃孵育過夜，次日清洗后滴加FITC標記的二抗（1∶200羊抗大鼠Ig G抗體）避光37℃孵育30 min，用碘化丙啶溶液染色30 min，清洗后用抗熒光淬滅封片劑封片，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍片，FITC經490 n m波長激發光激發后顯示綠色熒光，PI經530 n m波長的激發光激發后顯示紅色。

1.5 Wester n蛋白質印跡法檢測HK－2細胞E－鈣黏素、波形蛋白和CTGF的表達

HK－2細胞接種于10 c m細胞培養皿中，細胞培養貼壁生長至70%融合后，更換為無血清培養液同步培養24 h，按實驗分組換為不同的培養液。72 h后終止培養，裂解細胞后，收集裂解液于4℃，17 949×g離心30 min，取上清用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白質濃度，操作按說明書進行。用5×上樣緩沖液變性蛋白，取總蛋白60μg上樣，用10%SDS－PAGE凝膠進行電泳后，將蛋白轉印至PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST室溫搖床封閉2 h，分別加入一抗即小鼠抗人E－鈣黏素（1∶200），波形蛋白（1∶200），CTGF（1∶200）和β肌動蛋白（1∶2000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后分別加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1000），室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜后分別取等量ECL試劑盒溶液A和B液，混合后加于PVDF膜，避光反應 1 min，Bio－Rad 公 司 Molecular Imager Chemi DocTMXRS成像系統自動曝光掃描并用I magelab軟件對條帶進行分析，以所測得的各條帶的IA與內參照β肌動蛋白的IA的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 高糖對HK－2細胞ROCK活性的影響

圖1結果顯示，與未加高糖刺激前（0 min）比較，高糖60 mmol·L－1培養3 ～24 h后 HK－2細胞p－MYPT1－Thr696和p－MYPT 1－Thr 8 5 3蛋白表達明顯增加（P＜0.01），即ROCK活性明顯升高，提示在一定時間范圍內，高糖可以刺激HK－2細胞ROCK分子活化。

Fig.1 Effect of glucose 60 mmol·L－1 on activity of Rho－associated coiled－coil for ming pr otein serine／threonine kinase（ROCK）of HK－2 cells detected by co－immunoprecipitation assay.Lanes 1－7：HK－2 cells cultivated with glucose for 0，30 min，1，3，7，12 and 24 h，respectively.A2 and B2 were the semiquantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，compared with 0 min group.

2.2 法舒地爾對高糖培養的HK－2細胞α－SMA表達的影響

如圖2結果顯示，與正常對照組比較（圖2 A），高糖60 mmol·L－1培養 72 h 后 HK－2 細 胞 內α－SMA蛋白表達明顯增多（圖2C），高張組 HK－2細胞α－SMA蛋白表達無明顯變化（圖2B），提示高糖可成功誘導HK－2細胞表型轉換。與高糖組比較，高糖＋法舒地爾20μmol·L－1組α－SMA蛋白表達減少（圖2D）。

2.3 法舒地爾對高糖培養的HK－2細胞E－鈣黏素和波形蛋白表達的影響

如圖3和圖4結果顯示，與正常對照組比較，高糖60 mmol·L－1培養 HK－2細胞72 h后，細胞E－鈣黏素表達明顯減少（P＜0.01），波形蛋白表達明顯增多（P＜0.01），高張組無明顯變化，提示高糖可以誘導HK－2細胞向肌成纖維細胞轉化。與高糖組比較，法舒地爾同步干預72 h后E－鈣黏素表達增多（P＜0.01），波形蛋白表達減少（P＜0.01），且法舒地爾20μmol·L－1組改變更為明顯，法舒地爾3個濃度組組間比較差異有顯著性（P＜0.05），提示法舒地爾可抑制高糖誘導的HK－2細胞轉分化。

Fig.2 Effect of f asudil onα－smooth muscle actin（α－SMA）expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 for 72 h detected by i mmunocytochemistry（PI×400）.A：nor mal control group（glucose 5.5 mmol·L－1）；B：glucose 5.5 mmol·L－1＋mannitol 54.5 mmol·L－1（hight tension）；C：glucose 60 mmol·L－1；D：gl ucose 60 mmol·L－1＋fasudil 20μmol·L－1 group.Red color showsα－SMA positive expression.

Fig.3 Effect of fasudil on E－cadherin expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 f or 72 h detected by Wester n blotting.B was the semiquantitative result of A.1：normal contr ol gr oup；2：high tension group；3：gl ucose 60 mmol·L－1 group；4，5 and 6：gl ucose 60 mmol·L－1＋fasudil 5，10 and 20 μmol·L－1 gr oups，respectively.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；＃＃P＜0.01，co mpared wit h glucose 60 mmol·L－1 group.

Fig.4 Effect of f asudil on vi mentin expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 for 72 h detected by Wester n blotting.See Fig.3 f or t he legend.B was t he se miquantitative result of A.1：nor mal control group；2：high tension gr oup；3：glucose 60 mmol·L－1 group；4，5 and 6：high glucose 60 mmol·L－1＋fasudil 5，10 and 20μmol·L－1 gr oup，respectively.±s，n＝3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；＃＃P＜0.01，compared with gl ucose 60 mmol·L－1 group.

2.4 法舒地爾對高糖培養的HK－2細胞CTGF表達的影響

如圖5結果顯示，與正常對照組比較，高糖60 mmol·L－1培養 HK－2細胞72 h后，細胞CTGF表達明顯增多（P＜0.01），高張組無明顯變化。與高糖組比較，法舒地爾同步干預72 h后CTGF表達減少（P＜0.01），且法舒地爾20μmol·L－1組減少更為明顯，法舒地爾3個濃度組組間比較差異有顯著性（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of fasudil on connective tissue growth factor（CTGF）expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 for 72 h detected by Wester n blotting.See Fig.3 for t he legend.B was t he semiquantitative result of A.1：nor mal control group；2：high tension group；3：glucose 60 mmol·L－1 group；4，5 and 6：gl ucose 60 mmol·L－1＋fasudil 5，10 and 20μmol·L－1 gr oups，respectively.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，co mpared wit h normal control group；＃＃P＜0.01，compared with glucose 60 mmol·L－1 group.

3 討論

EMT是指上皮細胞在某些條件下轉分化為肌成纖維細胞，表現為失去上皮細胞的標志物E－鈣黏素而獲得肌成纖維細胞的標志物α－SMA和波形蛋白。EMT在DN的發生發展中起重要作用［14］。本研究結果表明，HK－2細胞在高糖60 mmol·L－1條件下培養72 h后，E－鈣黏素的表達減少，α－SMA和波形蛋白的表達增多，表明HK－2細胞在高糖誘導下發生EMT。因此，尋找新的干預措施逆轉EMT將是治療DN的新策略。

EMT的分子機制尚未完全闡明。Rho A／ROCK是TGF－β1的下游信號通路之一［15］，是近年的研究熱點。Masszi等［4］研究表明，Rho在 TGF－β1誘導的EMT中起核心作用。Patel等［5］也報道，Rho GTP酶的激活是EMT的關鍵步驟。本研究發現高糖60 mmol·L－1能使HK－2細胞ROCK信號通路激活，表明該通路參與了高糖誘導的EMT。因此推測，抑制ROCK信號通路可以抑制EMT。

法舒地爾是ROCK選擇性抑制劑，通過與ATP競爭ROCK催化區的ATP結合位點抑制ROCK的活性［16］。一些體外實驗也證實了法舒地爾在 DN 中的作用。Rodrigues－Díez等［13］報道，法舒地爾可以通過阻斷Rho A／ROCK信號通路抑制血管緊張素Ⅱ引起的HK－2細胞EMT。Ma等［17］研究發現，法舒地爾通過抑制高糖所激活的人系膜細胞Rho A／ROCK信號通路減輕高糖培養的系膜細胞炎癥和纖維化程度。本研究結果表明，高糖60 mmol·L－1誘導 HK－2細胞發生EMT，經法舒地爾同步干預后，細胞E－鈣黏素的表達增多，α－SMA和波形蛋白的表達減少，表明法舒地爾能夠抑制高糖誘導的腎小管EMT，提示法舒地爾對糖尿病性腎小管間質病變的治療作用，也進一步闡明法舒地爾對DN的治療作用機制。

CTGF是近年來發現與纖維化密切相關的細胞因子，它通過促進基質金屬蛋白酶合成、抑制基質金屬蛋白酶降解從而引起纖維化的發生［18］。有研究報道，CTGF可以導致腎小管發生EMT［19］。本研究發現，HK－2細胞在高糖60 mmol·L－1培養條件下培養72 h，CTGF的表達明顯增多，提示高糖誘導HK－2細胞發生EMT可能與CTGF介導有關。本研究還發現，高糖培養的HK－2細胞經法舒地爾同步干預后，CTGF的表達減少，且隨著法舒地爾濃度的增加作用更加明顯，表明法舒地爾抑制EMT可能部分是通過抑制CTGF的表達而介導的。

綜上所述，高糖可誘導HK－2細胞發生EMT，并能激活ROCK分子；法舒地爾能明顯抑制該EMT過程；法舒地爾抑制EMT的作用可能部分是通過抑制CTGF的表達而介導的。本研究為法舒地爾的腎保護作用提供了理論依據，并進一步明確了法舒地爾在DN治療中的應用價值。其作用機制尚需進一步探討。

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