戊巴比妥鈉處理后SD大鼠體內外精子運動功能分析

宋翼升，周國亮，由振強，辛艷飛，黃敏聰，宣堯仙

（浙江省醫學科學院安全性評價研究中心，浙江 杭州 310013）

戊巴比妥鈉屬一種巴比妥類麻醉劑，為中樞神經系統抑制藥物，隨劑量由小到大，相繼出現鎮靜、催眠、抗驚厥和麻醉作用。戊巴比妥鈉為中等藥效的催眠藥，作用時間可維持3～6 h，具有顯效較快、成本低廉和來源方便等特點，現主要用于動物實驗，是較為常用的麻醉藥物之一，對大鼠、小鼠和犬等都有很好的麻醉作用［1］。在以往的雄性生殖毒性試驗中一般采用頸椎脫臼法處死大鼠后再進行精子等的功能分析，隨著動物福利意識的加強，直接脫頸椎法已經不適應當前形勢，現在常采用麻醉后再取樣的方法。但是麻醉品對精子的活力是否有影響或者與藥物是否產生協同作用，本文采用體內和體外兩種給藥方案，運用計算機輔助分析儀研究戊巴比妥鈉對大鼠的精子運動功能的影響，為以后在生殖毒性雄性大鼠精子實驗中麻醉藥物的選擇與使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

戊巴比妥鈉，批號：WS20110112，購自上海西唐生物科技有限公司；無酚紅 M199培養液，批號：1115727，購自美國Gibco公司；無支原體胎牛血清，批號：120104，購自浙江天航生物科技有限公司；0.9%氯化鈉注射液，批號：2011060824，購自回音必集團（江西）東亞制藥有限公司。戊巴比妥鈉使用前用0.9%氯化鈉注射液配制成1%（W／V）溶液。M199培養液在臨用前中加入0.5%的無支原體胎牛血清，混勻，分裝并保存在37℃培養箱中。在體外實驗時，戊巴比妥鈉由含0.5%無支原體胎牛血清的M199培養液配制而成。

1.2 動物

SD雄性大鼠，45只，SPF級，體質量300～350 g，大于90 d齡，購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK（滬）2008－0016，動物質量合格證編號：2008001619942。大鼠飼養于屏障環境動物實驗室中，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，中央空調集中通風10～20次／h，光照12 h暗／12 h明，適應性飼養1周后進行實驗。

1.3 儀器

TOX－IVOS型計算機輔助精子分析儀，美國Hamilton公司產品，用于精子活力和濃度分析；2 X－CEL分析玻片的深度為80μm。PHG－9023 A型電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司產品。

1.4 體外實驗檢測精子的活力

SD大鼠3只，頸椎脫臼法處死，按文獻報道采用擴散法獲取精子［1］。分離附睪尾并迅速轉移到已預溫37℃的M199培養液中，用眼科剪剔除附睪尾上附著的脂肪組織。靜置1～2 min后將附睪尾轉移至另一個3 ml 37℃的M199培養液的培養皿中，用眼科剪沿附睪尾縱向切3～5刀，再將此培養皿置于37℃培養箱中擴散5 min，移去剩余的附睪組織即得精子懸液。將精子懸液保存在37℃恒溫培養箱中，吸取一定量的精子懸液與培養液按1∶9比例稀釋后，用計算機輔助精子分析儀測得精子密度為（6.36～6.78）×105L－1，之后吸取等量的精子懸液分成6組，其中5組同時加入戊巴比妥鈉，使戊巴比妥鈉終濃度為1000，100，10，1和0.1μmol·L－1，正常對照組則加入等量的M199培養液，每組做3個重復樣本。輕輕混勻后，放置于37℃恒溫培養箱中孵育，分別給予戊巴比妥鈉1和2 h后，用計算機輔助精子分析儀檢測精子活力（motility，MOT）及運動功能參數。抑制率（%）＝（MOTt－MOT0）／MOT0×100%，MOT0為77%，MOTt為暴露t時間后的精子活力。精子運動參數變化（%）＝戊巴比妥鈉組運動參數／對照組運動參數×100%。

1.5 體內實驗檢測精子的活力

SD大鼠42只按體質量隨機分成4組，每組7只，其中戊巴比妥鈉大鼠組經ip給予戊巴比妥鈉0.04 g·kg－1溶液，正常對照組給予0.9%的氯化鈉注射液，給藥容量均為4 ml·kg－1。戊巴比妥鈉組的大鼠分別在給藥后15，60及120 min進行解剖，迅速取出單側附睪尾稱質量并制備精子懸液，37℃孵育5 min后，精子懸液稀釋至精子密度為（4.95～7.46）×105L－1。正常對照組則用頸椎脫臼法處死后同法制備精子懸液。采用計算機輔助精子分析儀檢測精子活力。

1.6 大鼠精子運動能力檢測

預熱精子分析儀，使載物臺及分析玻片保持在37℃左右，吸取上述體外或體內實驗精子懸液10μl置于分析玻片上，在4倍鏡下，藍光，記錄精子運動的圖像，用計算機輔助精子分析儀分析精子運動軌跡，每個樣品至少觀察5個視野，使所觀察的精子總數大于200個。精子分析儀通過對影像的分析得出精子運動的相關參數，包括精子運動參數包括曲線運動速度（curvilinear velocity，VCL），平均路徑速度（average pat h vel ocity，VAP），直線運動速度（straight line velocity，VSL），鞭打頻率（beat cross frequency，BCF），精子頭側擺幅度（amplit ude of lateral head movement，AL H），直線性（linearity，LIN），前向性（straight ness，STR）等。整個實驗操作過程室溫不可低于27℃。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 戊巴比妥鈉對體外大鼠精子運動功能的影響

如圖1所示，與正常對照組相比，戊巴比妥鈉0.1，1，10，100和1000μmol·L－1對體外精子活力抑制率無明顯影響。與正常對照組比較，大鼠附睪精子體外給予戊巴比妥鈉0.1，1，10，100和1000μmol·L－11和2 h后，其附睪尾精子運動功能參數MOT，VCL，VAP，VSL，BCF，AL H，LIN和STR等均無顯著性差異（表1）；戊巴比妥鈉0.1，1，10，100 和 1000 μmol·L－1組 在 給 藥 后1和2 h后精子運動參數變化率與正常對照組沒有明顯差別，戊巴比妥鈉1000μmol·L－1組1和2 h后精子運動功能參數區間范圍分別為94%～107%和92%～108%（圖2）。戊巴比妥鈉1000μmol·L－1組的單個精子運動精力充沛，運動軌跡呈直線前進性（圖3B），與正常對照組相似（圖3 A）。

Fig.1 Effect of pentobar bital sodium （PS）on the motion of Sprague Dawley rat sper m in vitro for 1 and 2 h.The sper m suspensions were divided into 6 groups，cult ured wit h pentobar bital sodiu m 0（control），0.1，1，10，100，1000μmol·L－1 at 37℃f or 1 and 2 h.Inhibtory rate（%）＝（MOTt－MOT 0）／MOT 0×100%，MOT 0 means t he initial motility t hat is equal to 77%；MOTt means motilityafter PS treat ment f or t ti me.±s，n＝3.There was no significant difference compared with nor mal control group.

Tab.1 Effect of PS on motility parameters of epididy mal sper m of rats in vitro

Fig.2 Effect of PS on relative change rate of motility parameters computer－assisted sper m analysis for 1 h and 2 h in vitro.See Fig.1 f or treat ment.The relative change rate of motility parameters（%）＝val ue of motility parameter in pentobarbital sodiu m group／val ue of motility parameter in control group×100%.The abbrevation see Tab.1.STR（%）＝VSL／VAP×100%.LIN（%）＝VSL／VCL×100%.

2.2 戊巴比妥鈉對大鼠體內精子運動功能的影響

Fig.3 Effect of PS f or 2 h on representative sper m tracks and individual computer－assisted analysis of rat sper m in vitro.See Fig.1 f or treat ment.Individual sper m tracks were reconstr ucted fro m t he X，Y coor dinates saved into t he ASCⅡfiles.A：nor mal control group.B：PS 1000μmol·L－1 group.

如表2所示，SD大鼠ip注射戊巴比妥鈉15，60和120 min后，其附睪尾精子運動功能參數MOT，VCL，VAP，VSL，BCF，AL H，LIN，STR等與同時間正常對照組比較均無顯著性差異。戊巴比妥鈉組的單個精子運動精力充沛，精子運動軌跡呈直線前進性，與正常對照組相似。

Tab.2 Effect of PS on motility parameters of Cauda epididymal sper m in vivo

3 討論

近年來，隨著雄性生殖毒理研究的深入，提出了以精子形態結構和精子運動能力等作為雄性生殖功能影響重要觀察點［2］。一般認為，精子的運動包括兩方面，即運動速度和運動方式［3］。在研究技術上，傳統的精子活力測定方法是利用顯微鏡進行人工判斷，分析結果受到檢測者個人主觀因素的影響，實驗室中不同檢測者間以及不同實驗室間可比性較差。目前一般采用計算機輔助精子分析儀檢測精子運動能力，它是建立在顯微攝像基礎上的計算機精子運動圖像處理自動分析系統，重復性和一致性均優于人工檢測，并且能快速準確地測定精子的密度、活率、活力等參數，重復性好，可比性強，敏感性高，還可以提供描述精子實時運動狀態的多種參數［4］。

精子的運動能力是精子結構變化和功能狀況的綜合體現，是完成受精過程的基礎，在雄性生殖毒理學研究中都把其作為衡量精液質量的主要指標之一。精子運動功能參數中，精子活力下降會導致生育率下降［5－6］，VCL，VSL和 AL H 等運動參數與受精率呈明顯相關關系［4－5］，因此，精子的運動能力可作為男（雄）性生殖毒性評價的早期敏感指標。通過體外給藥實驗可以直觀、簡便地觀察到藥物對精子的活力是否存在直接影響，對雄性生殖毒理學研究有十分重要的意義。

動物實驗中常規使用的麻醉藥物主要有戊巴比妥鈉、鹽酸氯胺酮、烏拉坦、乙醚、三氟溴氯乙烷、氟烷、二氧化碳等。與其他麻醉藥相比，戊巴比妥鈉麻醉操作簡便，實驗過程無需專人管理麻醉，麻醉過程較平穩、安全，易保存，在動物實驗中廣受科研工作者的青睞。然而國內學者在戊巴比妥鈉對精子運動功能的影響方面研究甚少。本研究結果顯示，在戊巴比妥鈉體外濃度高達1000μmol·L－1時，作用120 min對精子的各運動功能參數均無明顯影響，精子的運動方式也并未改變，與正常對照組基本相似。體內實驗也發現戊巴比妥鈉對精子的運動速度參數VCL，VAP，VSL和BCF以及運動方式參數AL H，LIN和STR均無明顯影響，這與Sl ott等［7］報道的結果基本一致。

總之，戊巴比妥鈉給藥后，并不影響大鼠精子運動速度和運動方式，可以作為生殖毒性實驗的麻醉用藥，為將來雄性動物生殖毒性的研究工作提供了一定理論基礎。

［1］Dostal LA，Faber CK，Zandee J.Sper m motion para meters in vas deferens and cauda epididy mal rat sper m［J］.Repr od Toxicol，1996，10（3）：231－235.

［2］Linder RE，Strader LF，Slott VL，Suarez JD.Endpoints of sper matotoxicity in t he rat after short duration exposures to f ourteen reproductive toxicants［J］.Repr od Toxicol，1992，6（6）：491－505.

［3］Wyr obek AJ，Schrader SM， Perreault SD， Fenster L，Huszar G，Katz DF，et al.Assessment of reproductive disorders and birth defects in communities near hazardous chemical sites.Ⅲ.Guidelines f or field studies of male reproductive disor ders［J］.Reprod Toxicol，1997，11（2－3）：243－259.

［4］Moore HD，Akhondi MA.Fertilizing capacity of rat sper mat ozoa is correlated wit h decline in straight－line velocity measured by continuous co mputer－aided sper m analysis：epididymal rat sper matozoa from the proxi mal cauda have a greater fertilizing capacity in vitro than those from the distal cauda or vas deferens［J］.J Andr ol，1996，17（1）：50－60.

［5］Tot h GP， St ober JA， Zenick H， Read EJ，Christ SA，Smit h MK.Correlation of sper m motion para meters wit h fertility in rats treated subchronically with epichlorohydrin［J］.J Androl，1991，12（1）：54－61.

［6］Donnelly ET，Lewis SE，Mc Nally JA，Tho mpson W.In vitr o fertilization and pregnancy rates：t he influence of sper m motility and mor phology on IVF outco me［J］.Fertil Steril，1998，70（2）：305－314.

［7］Slott VL， Linder RE， Dyer CJ. Method of euthanasia does not affect sper m motility in the laboratory rat［J］.Reprod Toxicol，1994，8（4）：371－374.