細胞色素P450的性別依賴性表達及生長激素對其調控和機制的研究進展

楊 樹，李 燕

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所藥物代謝研究室，北京 100050)

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)又稱肝微粒體混合功能氧化酶，主要分布于肝細胞的滑面內質網，是參與藥物代謝的關鍵酶，其活性和表達水平具有明顯的個體差異并受遺傳、環境和年齡等因素影響。不同性別的個體肝中CYP的表達總量不同，特定CYP亞型在體內的分布表達及其酶的活性也存在性別差異性，如雌性大鼠CYP水平較雄性大鼠低10% ～30%。雄性大鼠體內CYP主要亞型為CYP2A2，CYP2C13和CYP2D1，而CYP2C11和CYP3A2僅在雄性體內分布;雌性大鼠體內CYP的主要亞型為CYP2A1，CYP2C7和CYP2E1，而CYP2C12僅在雌性體內分布［1］。在人體中主要的 CYP亞型為 CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1和CYP3A4，女性體內CYP3A4的活性要高于男性，而CYP2D6，CYP1A2及CYP2C19的活性則低于男性［2］。不同性別大鼠肝微粒體主要CYP酶的相互比較如表1所示。人肝CYP的主要亞型為CYP3A，但其在大鼠肝中濃度很低，CYP2C11和CYP2C12是大鼠肝主要的CYP亞型，但在人肝中根本不存在。

生長激素是由垂體分泌的一種肽類激素，其釋放模式受性別影響。雌大鼠的生長激素呈持續性釋放，整體水平及達峰濃度均較低;雄大鼠生長激素呈脈沖式釋放，僅在每3.5～4 h達釋放高峰時才能檢測到。人體中生長激素的釋放方式同大鼠一樣，表現為性別依賴性的釋放。上述體內生長激素因性別差異而釋放方式的不同可導致CYP表達不同，從而引起藥物代謝的性別差異。本文綜述了CYP的性別依賴性表達及生長激素在CYP性別依賴性表達中的作用及其分子機制。

表1 不同性別大鼠肝微粒體內所含細胞色素P450(CYP)酶亞型差異［1］

1 肝藥物代謝的性別差異與CYP性別依賴性表達

Nicholas等［3］研究發現，雌性大鼠ig給予巴比妥類后睡眠時間較雄性大鼠明顯延長，主要是由于雌鼠體內參與代謝的CYP含量較低，使藥物在雌鼠體內的代謝明顯慢于雄鼠，導致血藥濃度高而持久。

人體內CYP表達的差異可導致藥物代謝的性別差異。男性體內比女性清除率高的藥物有甲苯巴比妥、氯氮平、普萘洛爾、氯唑沙宗和右美沙芬等;男性體內比女性清除率低的藥物有紅霉素、維拉帕米、甲潑尼龍、潑尼松龍和茶堿等。Watkins等［4］研究表明，紅霉素在女性體內的代謝速率比男性快25%，其原因不是蛋白結合率差異，而是女性體內CYP3A4活性較高所致。由于女性肝主要參與藥物代謝的CYP3A4表達量高于男性，因此，抗腫瘤藥物異環磷酰胺在女性體內的N-去氯乙基反應更加明顯，產生神經毒性的風險也更大［5］。男性體內 CYP1A2的含量高于女性，鑒于CYP1A2是奧氮平和氨氯平等安定類藥物的主要代謝酶，因此，女性患者服用此藥后體內藥物代謝清除較慢、藥效持續時間長，其精神癥狀改善較男性患者更為明顯，但同時由于清除率低引起的藥物在體內蓄積從而產生的不良反應率也較高［6］。

2 生長激素對CYP的性別依賴性表達的調控

雌雄體內CYP表達不同是藥物代謝性別差異的重要原因，已知性激素對CYP表達有重要調節作用。雄性大鼠體內CYP含量高于雌性大鼠，去勢或給予雌激素可以明顯降低CYP含量和相對活性，而給予睪酮激素可恢復CYP水平和活性［7］。新生雄大鼠雄激素的水平預示了其成熟后體內CYP特異亞型的表達，也決定了該鼠體內是否能表達全套雄性CYP［8］。科學家曾經認為，性激素可直接影響CYP的表達，后來發現去勢雄性大鼠垂體切除后給予睪酮不能恢復CYP的雄性表達特征，由此才逐步認識完整的垂體系統在性激素對CYP表達的調控中必不可少。進一步研究表明，垂體前葉分泌的生長激素介導了性激素對CYP表達的調控，引起該酶表達的性別依賴性［9］。

生長激素是由193個氨基酸組成的蛋白質激素，其釋放受性激素調控并存在明顯的性別差異。雄大鼠生長激素以每隔3.5 h的脈沖方式釋放入血，峰值約為200μg·L-1，脈沖間隔期內(約2 h)檢測不到生長激素。而雌大鼠血中生長激素釋放較為頻繁，盡管達峰水平低于雄鼠，但生長激素20～30μg·L-1在血中持續存在。生長激素在雌雄體內不同的釋放方式引起CYP表達的性別差異。大鼠垂體切除后CYP表達的性別差異性消失，脈沖式給予生長激素可增加體內CYP含量，提高藥物代謝能力，而持續性給予生長激素則使CYP含量減少，使藥物代謝呈現雌性化特征。生長激素不同的釋放方式可影響特定CYP亞型的表達。Jarukamjorn等［10］研究發現，CYP2A4，CYP2B9，CYP2B10和CYP3A41在雌小鼠中的表達明顯高于雄小鼠，而雄小鼠中CYP2D9表達較高。雌小鼠脈沖式給予生長激素可以抑制CYP2A4等同工酶的表達，增加CYP2D9表達。與此相反，雄小鼠持續性給予生長激素可促進CYP2A4等表達，同時抑制CYP2D9表達。此外，L?fgren等［11］發現，在 CYP2C18 和 CYP2C19 轉基因大鼠中兩酶的基因表達具有雄性依賴性并可被持續給予生長激素所抑制。

人體內生長激素的釋放方式也由性激素調控，不同的釋放方式對肝中CYP表達的影響不一。生長激素缺乏的男性和女性患者通過脈沖式給予生長激素比持續性給予對CYP1A2活性的下調作用更加顯著，而持續性給予生長激素能明顯提高肝CYP3A4的活性［12］。持續給予生長激素可誘導原代肝細胞CYP3A4 mRNA和蛋白的表達，而脈沖式給予生長激素則產生抑制作用。

生長激素對CYP表達的影響呈現出生后的發育調控模式，即CYP的表達在未成熟期并不表現出性別差異，而是隨著年齡增長逐漸顯現。Waxman等［13］在CYP3A4轉基因大鼠的研究發現，雌鼠體內持續性生長激素釋放可誘導CYP3A4 mRNA和蛋白的表達;未成熟期雄大鼠肝可表達CYP3A4，但出生6周后表達水平明顯下降并低于檢測限，而轉基因雌大鼠在未成熟期和成年期均有CYP3A4表達;雄大鼠CYP3A4表達在成年期檢測不到，而雌鼠CYP3A4在成年期仍有表達。肝CYP3A4的表達在轉基因大鼠的成年期出現性別差異而不是未成熟期，是因為生長激素性別依賴性的釋放方式源于新生兒期性激素對下丘腦的作用，青春期開始明顯并一直持續至成年期，特定CYP亞型的表達是由性激素和下丘腦-垂體軸所調控的［14］。

3 生長激素調控的CYP性別依賴性基因的分類

性別依賴性CYP基因根據生長激素的不同調控方式可分為Ⅰ類和Ⅱ類基因。Ⅰ類基因受生長激素的正調控，其表達需要生長激素的參與，垂體切除后其表達下降。Ⅱ類基因受生長激素的負調控，生長激素存在時抑制其表達，垂體切除后其表達增加。CYP2C11是Ⅰ類雄性依賴性基因，其表達需要生長激素的刺激，每隔100～140 min脈沖式給予雄性大鼠生長激素可促進CYP2C11表達，停止給予生長激素后，其表達下降到正常水平的25%～30%。而持續性的生長激素釋放則為Ⅰ類雌性依賴性基因CYP2C12表達所必需，大鼠垂體切除后，其表達需要持續性給予生長激素，雄大鼠CYP2C12的表達可被持續性地給予生長激素誘導至正常雌鼠水平。CYP2A2，CYP2C13和CYP3A2屬于Ⅱ類雄性依賴性基因，垂體切除后，其表達水平達到最高，持續性生長激素釋放則完全抑制其表達。Ⅱ類雄性依賴性基因同時也受到脈沖式釋放的生長激素抑制，因此，其表達是在生長激素脈沖式釋放的間隔期內，呈間斷性表達。Ⅱ類基因CYP2A1和CYP2B9表達呈現雌性依賴性是因為持續性生長激素釋放對其的抑制要弱于脈沖式生長激素釋放［15］。

4 生長激素對CYP性別依賴性表達調控的機制

4.1 信號轉導子和轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)5b在生長激素對CYP表達調控中的作用

生長激素與細胞表面的生長激素受體結合，引起非受體酪氨酸激酶JAK2構象變化從而激活該酶，活化的JAK2可以使生長激素受體上的酪氨酸殘基磷酸化，為一系列信號轉導蛋白提供結合位點，從而激活下游的信號轉導通路。STAT家族是生長激素對胰島素樣生長因子-1(insulin growth factor，IGF-1)和某些轉錄因子和藥物代謝酶表達調控過程中的重要信號轉導蛋白。生長激素激活的JAK2至少使4種STAT家族蛋白(STAT1，STAT3，STAT5a和 STAT5b)磷酸化，STAT被磷酸化后可以形成二聚體從而進入細胞核內，同相應的DNA反應元件結合引起基因轉錄，其中STAT5a和STAT5b在生長激素影響肝CYP表達中發揮重要作用［16］。

STAT5a和STAT5b的結構具有90%的相似性，均含有保守的SH2結合區和位于羧基端以及可被磷酸化的酪氨酸位點。其中SH2結合域介導STAT與磷酸化的生長激素受體結合，結合后的STAT可被JAK2磷酸化后形成STAT二聚體，使得STAT被活化。STAT5a除在乳腺發育中發揮重要的生理作用，還同某些CYP表達有關。STAT5a缺失的雌小鼠肝中CYP2A12，CYP2D22，CYP3A16和 CYP8B1的表達下降［17］。STAT5b的活性與生長激素的釋放相關并具有性別差異性。雄大鼠STAT5b可被脈沖式釋放的生長激素激活，在生長激素的脈沖間隔期內活性也隨之下降，而雌大鼠持續性生長激素釋放使STAT5b的活性維持在較低水平。Holloway等［18］研究發現，在STAT5b缺失雄小鼠中，雄性依賴性CYP2D9，CYP7B1，CYP4A12表達下降至雌小鼠水平，而CYP2B9，CYP2B10，CYP2B13，CYP2A16，CYP3A41 和CYP3A44等6種雌性依賴性CYP基因的表達則明顯上升，提示STAT5b促進雄小鼠體內雄性依賴性CY450的表達，而對雌性依賴性CYP表達產生抑制作用。野生型雄小鼠垂體切除后，脈沖式給予生長激素可恢復雄性依賴性CYP的表達，說明STAT5b在生長激素影響雄小鼠CYP的表達中有不可或缺的作用［19］。

已知生長激素的分泌可受某些神經內分泌激素控制，通過調節這些激素可導致雄小鼠CYP表達的雌性化。眾所周知，垂體分泌生長激素受兩種下丘腦激素調控，即生長抑素和促生長激素釋放素，前者抑制生長激素釋放，后者促進生長激素釋放。Bennet等［20］發現，STAT5b缺陷小鼠生長抑素的mRNA轉錄降低，提示STAT5b可促進生長抑素的表達，在生長激素引起的生長抑素反饋調節中具有重要作用。STAT5b缺失將導致生長抑素表達減少，生長激素釋放抑制的減弱，血中生長激素持續性釋放，CYP表達呈雌性化特征。生長激素結合生長激素受體后激活STAT5b引起IGF-1表達，而IGF-1可抑制生長激素釋放。STAT5b缺失可降低IGF-1的表達，反饋性地減弱對生長激素釋放的抑制作用，血中生長激素含量升高，導致CYP表達呈雌性化［21］。

Laz等［22］通過染色質免疫沉淀反應的方法發現，STAT5b直接與DNA相應的結合區結合影響基因轉錄，其結合的頻率同脈沖式生長激素釋放的頻率相吻合。但也有兩項研究表明，STAT5b可能并不是介導生長激素對CYP表達調控的唯一因子。首先，垂體切除大鼠給予一次脈沖式釋放的生長激素可在5～10 min內激活STAT5b，但相應的基因轉錄卻沒有同步發生。其次，雄大鼠持續給予生長激素引起STAT5b活性下降但引起其基因表達呈現雌性化特征的過程卻較慢［23］。因此，除了STAT5b外，可能還有其他的轉錄因子參與。Gardmo等［24］研究表明，雌大鼠生長激素對雌性依賴性CYP2C12表達的調控需要HNF6，HNF3α和HNF3β等轉錄激活因子的參與。肝細胞核因子(hepatic nuclear factor，HNF)6是一種主要在雌大鼠中表達的轉錄因子，受生長激素調控并參與CYP2C12表達。雄大鼠持續給予生長激素或STAT5b缺乏均可增加轉錄抑制蛋白表達，從而導致雄性依賴性CYP2C11表達的下降［25］。Bcl-6是主要在雄小鼠表達并受生長激素調控的轉錄抑制蛋白，競爭性地結合STAT5的靶點從而抑制CYP2C12的表達［26］。

4.2 肝細胞核因子4α在生長激素對CYP表達調控中的作用

在介導生長激素對CYP表達影響的轉錄因子中，除了STAT5b，最為重要的還有HNF4α。HNF4α是位于肝的轉錄因子，參與肝的正常生長和基本功能的調節，包括脂代謝平衡、脂蛋白及膽酸的合成。Holloway等［27］研究表明，HNF4α或STAT5b缺失后對雄小鼠肝中性別依賴性基因表達的影響存在相似性。與STAT5b一樣，HNF4α可促進雄小鼠體內雄性依賴性CYP的表達而對部分雌性依賴性CYP表達存在抑制作用。Nakayama等［28］研究發現，雄小鼠 CYP2A4，CYP3A16和CYP2C12基因的啟動子域中有HNF4α的功能結合位點，提示這些基因的完全表達需要HNF4α的參與。人體CYP2B6基因的HNF4α結合位點如出現單個核苷酸的多態性可引起該基因表達的多態性［29］。Jover等［30］研究表明，人原代肝細胞中CYP3A4，CYP3A5和CYP2A6的表達需要HNF4α的參與。因此，HNF4α是通過結合CYP基因上的特定區域從而激活該基因的表達，影響CYP在不同性別體內的表達含量。

Odom等［31］通過染色質免疫沉淀法發現了HNF4α調控基因上的HNF4α功能結合域，證實HNF4α通過與DNA結合域直接結合發揮作用。雄性大鼠肝HNF4α蛋白含量和DNA結合域的活性是雌性大鼠的5倍，因此，受HNF4α調控的CYP表達存在雌雄差異。

HNF4α可通過與CYP3A41啟動序列上的-99/-87區域結合從而增加其表達活性。組蛋白H3第4賴氨酸甲基化可使染色質結構開放，而組蛋白H3第27賴氨酸甲基化則抑制基因轉錄，保持異染色質狀態。相比雄小鼠，雌小鼠CYP3A41基因啟動子內組蛋白H3第4賴氨酸甲基化和低組蛋白H3第27賴氨酸甲基化水平高使染色質的結構更易于HNF4α與其結合位點的結合，從而增加CYP3A41基因表達［32］。

STAT5b與HNF4α可協同參與對CYP表達的調控，Wiwi等［33］研究發現，STAT5b 可增強 HNF4α 對 CYP2D9 和CYP8B1表達的激活作用。HNF4α和STAT5b可協同激活轉錄因子HNF6，從而改變CYP2C12的表達［34］。

4.3 表觀遺傳在生長激素對CYP表達的調控中的作用

表觀遺傳修飾即不改變基因序列，通過基因修飾，蛋白與蛋白、DNA和其他分子相互作用而影響基因功能和特性。某些修飾表觀遺傳的方式，如DNA胞嘧啶一磷酸鳥嘌呤甲基化、組蛋白翻譯后的修飾以及與非編碼RNA的相互作用，可以導致常染色質轉變為異染色質從而抑制基因表達［35］。染色質易接觸性改變一直是基因轉錄調控中的重要環節［36］。研究表明，CYP2C11和CYP2C12基因的啟動域存有DNA酶Ⅰ高度敏感的結合位點并具有性別和生長激素依賴性。這些超敏位點含有特異的DNA序列，為特異性DNA結合蛋白識別從而參與基因轉錄。生長激素通過STAT5b與HNF4α調控引起的染色質易接觸性變化可能導致CYP表達的性別差異［37］。

常染色質處于伸展狀態，易于轉錄。而異染色質處于固縮凝集狀態，不易于轉錄。持續給予生長激素使得常染色質轉變為異染色質從而引起雄性依賴性CYP表達的抑制，而在STAT5b和HNF4α缺失大鼠中出現的雌性特異性CYP表達激活則可能是異染色質轉變為常染色質［38］。

此外，持續給予生長激素可誘導雄性成年大鼠CYP3A16，CYP3A41和 CYP3A44表達，即使在 STAT5b缺失情況下也會出現，說明生長激素可激活不依賴于STAT5b的信號轉導通路，如絲裂原激活蛋白激酶通路。以上CYP3A16，CYP3A41和CYP3A44基因均在未成熟期雄性和雌性大鼠表達，進入青春期后雄性大鼠的蛋白表達下調，可能源自持久性緊縮異染色質結構的形成［39］。

5 展望

生長激素可通過STAT5b和HNF4α等轉錄因子調控CYP的性別特異性表達，從而影響藥物代謝的性別差異。生長激素調控的信號轉導通路涉及到多個轉錄因子的參與，這些轉錄因子的表達受到生長激素不同釋放方式的影響，明確轉錄因子同生長激素的相互作用以及對CYP表達的影響將有助于加深理解生長激素的分子調控機制。CYP家族種類繁多，確定更多的受生長激素影響的特定CYP亞型將是進一步的研究目標。生長激素可促進一些激素蛋白的表達，如胰島素樣生長因子等，這些激素在生長激素對CYP調控中所起的作用也是值得關注的方向。生長激素除影響CYP表達外，對肝其他蛋白的表達也有一定作用，如受體、信號分子和參與脂類及外源物代謝的酶類，涉及機體的脂代謝平衡、免疫炎癥和疾病狀態等多個生理病理反應，研究生長激素對上述蛋白表達的調控還有利于認識和解釋某些疾病的性別差異。

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