哈密馬奶酒中7 株乳酸菌分離株發酵性能研究

張偉欽 妥彥峰 許 倩 王 葉

(1 塔里木大學生命科學學院/南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾843300)(2 光明乳業研究院乳品生物技術國家重點實驗室，上海 200070)

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是人體腸道中的正常菌群，并且作為發酵劑在發酵乳制品生產中普遍使用，具有長期的安全食用史［1］。乳酸菌不但賦予發酵食品特有的風味，還具有一定的益生功能，Metchnikoff 在1908年首次提出攝食發酵食品對人體具有保健功能，而發酵食品的保健功能得益于其中的微生物，現已清楚發酵食品中的乳酸菌對人體具有多種保健功能，如提高機體免疫力［2］，防止腸致病性微生物感染［3］，防止誘變劑損傷機體和預防腫瘤的發生［4］。

新疆哈薩克族百姓長期制作和食用傳統發酵乳制品，如馬奶酒、奶疙瘩、酸奶等，這些乳制品中含有豐富的乳酸菌資源。其中馬奶酒是以新鮮馬奶為原料，經乳桿菌屬細菌和酵母等微生物共同自然發酵形成的酸性低酒精度乳飲品。在馬奶發酵成熟過程中，乳桿菌屬細菌和酵母構成其優勢微生物類群，賦予馬奶酒獨特的風味特征［5］。

從傳統發酵馬奶酒中可以分離篩選獲得具有益生功能及優良發酵性能的乳酸菌菌株。本研究從新疆哈密地區哈薩克族牧民家庭采集4 份馬奶酒樣品，對所分離出的乳酸菌進行了產酸、后酸化、耐酸性能及耐膽鹽能力篩選試驗，旨在篩選出產酸能力，耐酸及耐膽鹽性能強，后酸化能力弱的乳酸菌株，為進一步開發乳酸菌發酵劑提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與供試菌株

4 份馬奶酒樣品均采自新疆維吾爾族自治區哈密巴里坤地區牧民家庭，是由哈薩克族牧民家庭用傳統工藝釀造。試驗所用菌株為樣品中分離出的7株乳酸菌。

1.1.2 培養基

乳酸菌株的分離及富集培養采用MRS 培養基［6］。產酸能力測定試驗采用12%(w/v)脫脂乳培養基。

1.1.3 主要儀器與設備

LDZX－40BI 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、SW－CJ－1F 超凈工作臺、BX 50 奧林巴斯光學顯微鏡，恒溫培養箱，pH 計等。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌株的篩選

1.2.1.1 將樣品于無菌條件下進行10 倍梯度稀釋，取10－3、10－4兩個稀釋度，各取0.1 mL 稀釋液涂布于MRS 固體平板培養基，置于37℃恒溫培養箱中培養48 h。

1.2.1.2 觀察菌落，將菌落較小，直徑約1～3 mm，圓形隆起，表面光滑或稍有粗糙，呈乳白色，灰白色或暗黃色的特征性菌落劃線接種到MRS 固體平板培養基進行進一步純化，對再次長出的特征性菌落進行革蘭氏染色，確定是否為純菌。對分純的菌株進行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗，革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌。分離獲得的乳酸菌在MRS 液體培養基中傳代培養，并于4℃保存待用。臨用前活化傳代2 次，使菌株活力恢復。

1.2.1.3 將傳代后的乳酸菌菌株接入脫脂乳培養基，于37℃培養，選擇能夠使脫脂乳10 h 內凝乳，表面無乳清析出或少量乳清析出的菌株，進行后續試驗。

1.2.2 乳酸菌株的產酸能力測定

將乳酸菌株按2%接種量接種至滅菌脫脂乳培養基，于37℃恒溫培養箱培養，每隔1 h 取兩個平行樣品測定滴定酸度，連續測定8 h，并作酸度隨時間變化的曲線圖。以此來判斷乳酸菌的產酸能力［11］。滴定酸度測定方法見國家標準GB/T 5409－1985［7］。

1.2.3 乳酸菌株后酸化能力測定

將乳酸菌株按2%接種量接種至滅菌脫脂乳培養基，37℃培養至凝乳后置于4℃冰箱保存。測定凝乳在冷藏第12、24、36、48、60、72、84 h 時的滴定酸度［7］，每次測定兩個平行樣品。通過計算酸奶在冷藏過程酸度的增加值來判斷乳酸菌后酸化能力的強弱。

1.2.4 乳酸菌株耐膽鹽能力測定

將活化后的菌株按2%接種量接種至膽鹽濃度分別 為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的MRS 液體培養基中，置于37℃培養箱培養，每隔1 h 采用涂布法做菌落計數，每個稀釋度做兩個平行，連續測定4 h，根據菌落數的變化確定菌株耐膽鹽能力。

1.2.5 乳酸菌株耐酸能力測定

將活化后的菌株按2% 接種量接種至pH 為2.5的MRS 液體培養基中，置于37℃培養箱培養，每隔1 h 采用涂布法做菌落計數，每個稀釋度做兩個平行，連續測定3 h，根據菌落數的變化確定菌株耐酸能力。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌株的篩選

經形態觀察、革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，共篩選得到7 株乳酸菌(編號為M3.2、M3.3、M3.4、M4.2、M4.6、M4.7、M4.8)，均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性，長桿狀或短桿狀，且凝乳狀態良好，初步確定為乳桿菌屬細菌。

2.2 乳酸菌的產酸能力

圖1 所分離乳酸菌株的產酸能力曲線

乳酸菌株的產酸能力高低影響酸奶加工周期的長短、生產效率的高低和風味的優劣，是一個重要的質量指標。本試驗通過繪制乳酸菌株在脫脂乳凝乳過程中酸度隨時間變化的曲線來確定菌株產酸能力的強弱。

從7 株乳酸菌株產酸曲線圖(圖1)可以看出，前3 h 乳酸菌產酸速率很低，3～6 h，M3.2、M3.3、M3.4 產酸速率增大;M4.2、M4.6、M4.7、M4.8 產酸速率相對緩慢平穩;6～8 h，M3.2、M3.3、M3.4 產酸速率降低，酸度達到高峰，趨于穩定;M4.2、M4.7、M4.8 產酸速率依舊緩慢平穩;M4.6 產酸速率增大。綜上，7 株乳酸菌產酸能力強弱順序為:M3.3＞M3.2 ＞M3.4 ＞M4.6 ＞M4.7 ＞M4.8 ＞M4.2。

2.3 乳酸菌后酸化能力

圖2 所分離乳酸菌株的后酸化性能曲線

優良酸奶發酵劑的乳酸菌株應具備后酸化性能弱的特點。后酸化能力弱的發酵劑，一般在5℃貯藏3 周后，滴定酸度僅增加7.5～10.0 °T［8］。經過84 h的冷藏，7 株乳酸菌發酵酸奶的酸度有所變化，但變化不大，呈緩慢上升趨勢(圖2)。從酸奶冷藏過程中的酸度變化可以看出，M4.7 酸度增加24 °T，M4.2 酸度增加22 °T，M4.6 酸度增加21 °T，M3.3酸度增加17 °T，M3.2 酸度增加10 °T，M3.4 酸度增加5 °T，M4.8 酸度增加2 °T，從幾株菌后酸化過程中滴定酸度的差值可看出，M3.2、M3.4、M4.8 后酸化能力較弱。

2.4 乳酸菌株耐膽鹽能力的測定

健康人體腸道中膽鹽濃度在0.1%～0.5%范圍，本試驗通過調節MRS 培養基中膽鹽濃度，模擬人體腸道環境。食物通過人體腸道的時間，最長為4 h，4 h 后菌株仍存活，菌株的耐膽鹽能力越強。具有較強膽鹽耐受性的菌株，可在腸道存活，從而發揮益生功能。

所分離乳酸菌耐膽鹽的測定結果見表1。當膽鹽濃度分別為0.3%、0.4%、0.5%時，7 株菌僅在第0 h 時測得有活菌存在，第1～4 h 均無活菌存在，故相應數據未在表1 中列出。除菌株M4.8，其它菌株在膽鹽濃度為0.1%時保持4 h，均有不同程度的增殖，說明菌株M3.2、M3.3、M3.4、M4.2、M4.6 和M4.7 均可在0.1%膽鹽濃度條件下存活，并有一定量的增殖;當菌株在膽鹽濃度為0.2%時保持4 h，菌株M3.2、M4.2 和M4.6 均有存活，而其它菌株均無存活，因此菌株M3.2、M4.2 和M4.6 具有較好的膽鹽耐受能力。

2.5 乳酸菌株耐酸能力的測定

乳酸菌口服進入宿主后的生存障礙首先是胃的低pH 值。單胃動物胃液的pH 隨飲食變化波動很大，胃液pH 一般在2.0 左右，進食后pH 可達3.0～5.0 之間，食物被胃消化大約需要2～4 h。所以本試驗選擇將MRS 培養基pH 值調為2.5，乳酸菌培養時間為3 h，模擬菌株在人體胃環境的生長情況，篩選具有耐酸能力的菌株，結果見表2 所示。

在pH2.5 條件下保持1 h，所有菌株均有不同程度的增殖;在pH2.5 條件下保持3 h，菌株M3.2、M3.4、M4.2 和M4.7 均有存活、耐酸性較好，而菌株M3.3、M4.8、M4.6 不能存活。

表2 所分離乳酸菌株耐酸能力測定

3 結論

從新疆哈密地區采集的4 份馬奶酒樣品中共篩選出7 株乳酸菌，M3.2、M3.3、M3.4 產酸能力較強，M3.2、M3.4、M4.8 后酸化能力較弱，M3.2、M4.2 和M4.6 耐膽鹽能力較強。M3.2、M3.4、M4.2 和M4.7 耐酸能力較強。四種性能測定中，M3.2 菌株滿足了產酸能力強，后酸化能力弱，耐膽鹽及耐酸能力強的特性，還需要進行菌株對發酵乳質構、風味影響的研究，以及不同菌株混合發酵性能的測定，為制備混合型酸奶發酵劑提供理論依據。

［1］Ahrne S，Nobaek S，Jeppsson B，et al.The normal Lactobacillus flora of healthy human rectal and oral mucosa［J］.Journal of Applied Microbiology，1998，85:88－94.

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［3］Reid G，Jass J，Sebulsky M T，et al.Potential uses of probiotics in clinical practice［J］.Clinical Microbiology Reviews，2003，16:658－672.

［4］Tuo Y F，Zhang L W，Yi H X，et al.Antiproliferative effect of wild Lactobacillus strains isolated from fermented foods on HT－29 cells［J］.Journal of Dairy Science.2010，93(6):2362－2366.

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［6］陳天壽.微生物培養基的制造與應用［M］.第1 版.北京:中國農業出版社，1995:301－383.

［7］GB/T 5409－1985.牛乳檢驗方法［S］.

［8］許本發.酸奶和乳酸菌飲料加工［M］.第1版.北京:中國輕工業出版社，1994:32－36.