極端嗜鹽古菌TRM 51T的多相分類研究

任 敏 歹明輝 夏占峰

(新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

極端嗜鹽古菌(Extremely halophilic archaea)是一類生活在高鹽環境的微生物類群，其獨特的遺傳特質、生理生化特性以及進化世系使其具有重要的理論研究意義和應用研究價值。目前，極端嗜鹽古菌資源與分類學研究主要采用多相分類學的理論與技術集中在三個層次特征:表型特征、化學特征(主要是極性脂的組分)、基因型特征(16S rDNA 和DNA–DNA 雜交、G+C 含量mol%)［6］的研究。到目前為止，嗜鹽菌科包括36 個屬，129 個種［7］。

新疆擁有豐富的鹽湖資源，不同類型的鹽湖蘊藏著各不相同的嗜鹽古菌資源。為豐富嗜鹽古菌物種多樣性，并為進一步的理論與應用研究提供菌種資源。本研究采集新疆阿圖什市境內的硝爾庫勒湖鹽湖土壤樣品［1］，利用純培養技術分離其土壤樣品得到多株極端嗜鹽古菌，通過對分離菌株的16S rDNA 基因擴增測序后，對潛在新物種TRM51T進行形態鑒定、革蘭氏染色、生長鹽濃度試驗、Mg2+濃度試驗、生長pH 范圍、生理生化鑒定、極性脂組成、16S rDNA 基因序列等分析，確定TRM 51T屬于極端嗜鹽古菌科中的新屬類群。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株TRM 51T從新疆硝爾庫勒湖(76°53＇E，40°10＇N)中分離得到純培養物(GenBank/EMBL/DDBJ登錄號為 JN166404);標準菌株 Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T、Haloarcula vallismortis CGMCC1.2048T、Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T(=Halopiger xanaduensis JCM 14033T)、Halopiger aswanensis JCM 11628T等購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)和日本菌種保藏中心(Japan Collection of Microorganisms，JCM)。所有菌株均在CM 培養基上進行多相分類鑒定［3］。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態學特征 細胞形態及運動性按照文獻［3］進行。

1.2.2 生理生化鑒定 生長所需鹽濃度范圍及最適NaCl、MgCl2濃度、生長pH 及溫度范圍依照極端嗜鹽古菌新分類單元描述標準中的方法［5－6］。

1.2.3 生長條件實驗 硝酸鹽、精氨酸和二甲基亞砜的厭氧實驗，硝酸鹽、亞硝酸鹽還原，硝酸鹽產氣，H2S 產氣，碳氮源利用及抗生素敏感實驗均按照文獻［3］進行。

1.2.4 基因型分類特征

1.2.4.1 菌株16S rDNA 基因序列分析

根據文獻［2］提取菌體DNA，沉淀溶于滅菌的超純水中;嗜鹽古菌16S rDNA 基因序列的PCR 擴增使用特異性引物F1:5＇－TTCCGGTTGATCCTGCC－3＇;R1::5＇－AAGGAGGTGATCCAGCC－3＇［3］。PCR 反應體系:10 ×Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mM each)3μL，F1(10 μM)0.5 μL，R1(10 μM)0.5 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.3 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 補至25 μL。PCR 反應條件:95℃5 min ;95℃1 min ;51℃1 min ;72℃1.5 min ;30 個循環;72℃10 min。

取3 μL PCR 擴增產物與一定比例的上樣緩沖液混合后進行瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠，1 ×TAE 電泳緩沖液，100 V 電泳30 min)，EB(0.5 μg/mL)染色后在凝膠成像系統用紫外光透射觀察結果，拍攝電泳圖，PCR 產物為約1.5 kb，PCR 產物膠回收后與pMD18－T 載體連接，轉化入DH5α 大腸桿菌中，菌落PCR 驗證后，選取陽性克隆12 個，送由上海生物工程有限公司測序。

1.2.4.2 基于16S rDNA 基因的系統發育學分析

測序結果用DNAStar 軟件包中的SeqMan 軟件剪輯，所得序列通過Eztaxon server 2.1 在線分析，確定其潛在的分類地位，下載相關序列，并采用MEGA5.0［9］軟件包中的Clustal W 進行多序列比對，運用Kimura 2－Parameter Distance 模型及Neighbor－Joining 法，設定Bootstrap 值為1000 次來構建系統發育樹［9］。

1.2.4.3 DNA G+C mol%含量的測定

基因組DNA的提取方法參見Marmur (1961)，G+C mol%含量通過反相HPLC 法(Mesbah et al，1989)測定。根據樣品色譜圖中各種脫氧核糖核苷酸的峰面積對DNA G+C mol %進行計算。

DNA G+C mol %含量的計算公式:

1.2.5 化學分類特征

根據崔恒林的方法［3］，對培養好的200 ml 菌液(OD600為1.0 以上)提取極性脂，取6 uL 在10 cm×10 cm的硅膠板(Merk 公司，25TLC aluminium sheets 20 ×20 cmSilica gel 60F254)進行單向TLC 檢測菌體的磷脂。同時取等量上述極性脂在10 cm×20 cm的硅膠板雙向TLC，檢測糖脂組份。

2 結果

2.1 形態與生長特征

菌株TRM 51T為革蘭氏陰性菌(圖2)，牛奶鹽平板上培養至7d 時菌落呈圓形，淡粉色，表面光滑濕潤，有黏性，邊緣較整齊，菌落直徑約為1～2 mm(圖1)。細胞呈桿狀，菌株大小2.73～18.81 μm，無鞭毛，能運動(圖3)。

圖1 TRM 51T 菌落形態

圖2 TRM 5T 革蘭氏染色

圖3 TRM 51T 電鏡照片

2.2 營養特性

菌株TRM 51T生長的NaCl 濃度為2.1～4.3 M，最適生長NaCl 濃度為3.1 M，pH 生長范圍6.0～9.0(最適pH 8.0)，溫度范圍28～50℃(最適生長溫度 37℃)，而相近菌株 Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T和 Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T的NaCl 濃度分別為2.5～5.0 M、2.2～4.0 M，它們的最適生長NaCl 濃度分別為4.3 M、3.1 M，其pH 范圍6.0～11.0(最適pH7.5～8.0)、6.5～9.0(最適pH7.0)，其生長溫度范圍28～45℃(最適生長溫度37℃)、35～58℃(最適生長溫度50℃)。

2.3 生化特征

菌株TRM 51T進行生理生化特性表現為:水解淀粉，液化明膠，不生成H2S，不水解吐溫80，吲哚實驗陰性，氧化酶、過氧化氫酶陽性，硝酸鹽還原實驗陽性，不能利用硝酸鹽、精氨酸和DMSO。

TRM51T利用葡萄糖、果糖、D－ 核糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇、D－山梨醇、醋酸鹽、DL－乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、L－鳥氨酸、L－脯氨酸、L－谷氨酸、鹽酪氨酸、精氨酸等作為唯一碳源、能源生長;不能利用甘露糖、半乳糖、L－山梨糖、D－木糖、L－天冬氨酸、L－谷氨酸、L－賴氨酸、L－絲氨酸、L－亮氨酸等;TRM51T與相近物 種 Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T、Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T在碳、氮源的利用上存在差異(如表1)。

表1 TRM 51T 與相近種的生化特征

2.4 抗生素敏感

TRM51T對桿菌肽、新生霉素、甲氧芐氨嘧啶敏感;對紅霉素、新霉素、利福平、氯霉素、氨芐青霉素、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、四環素、萬古霉素、制霉菌素、呋喃妥因、萘啶酸等不敏感。而Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T對甲氧芐氨嘧啶不敏感和對利福平敏感，與 TRM51T不同;Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T對 利 福平、呋喃妥因敏感，與TRM51T不同。

2.5 基因型特征

2.5.1 16S rDNA 基因擴增

采用古菌通用引物，對TRM51T所提取的基因組DNA 進行16SrDNA 基因序列進行擴增并測序，得到幾乎全長的16S rDNA 基因序列，經過電泳檢測，條帶大小約為1.5kb(如圖4)。序列提交NCBI并獲得GenBank 登錄號(JN166404)。

圖4 TRM 51T 16S rDNA的PCR 瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.5.2 16S rDNA 基因序列系統發育樹分析

克隆測序后，所得序列進行拼接，TRM 51T的16S rDNA 基因序列為1472 bp，與有效發表的參比菌株Halopiger 同源性處于94.2%～95.3%之間，從各菌株以16S rDNA 基因序列為基礎構成的系統發育樹(見圖5)，可以看出相比較于Haloterrigena、Halopiger、Natrinema 等屬，TRM 51T形成一獨立分支，將TRM 51T歸入新的屬級分類單元。(采用鄰接法構建的系統進化樹，表明菌株TRM51T在嗜鹽菌科的分類地位。Methanospirillum hungatei JF－1(NR 042789)作為外群。自舉值選取1000(1000 次重復取樣，大于50%的數值被標出)。標尺0.02 代表200 個核苷酸。

圖5 基于16S rDNA 基因序列構建的極端嗜鹽古菌系統發育N－J 樹)

2.5.3 基因組DNA的G+C mol%含量

菌株TRM 51T、Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T、Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T基因組DNA G+C mol% 含量分別為63.2%(Tm)、63.1%(Tm)、61.9%(Tm)，其值均大于60，屬于高G+C的革蘭氏陰性菌。

2.6 嗜鹽古菌細胞極性脂組分

TRM 51T單向TLC 條帶與參比菌株的條帶相比，TRM 51T含有TGD－2(如圖6);菌株TRM51T細胞中主要的磷脂組分為PG(磷脂酰甘油)、PGPMe(磷脂酰甘油磷酸甲基酯)、TGD－2(葡糖苷甘露糖苷葡糖二醚)，明顯與相近菌株Halopiger aswanensis JCM 11628T雙向TLC 不同(如圖7)。

圖6 嗜鹽古菌菌株TRM51T 糖脂TLC 圖譜

圖7 嗜鹽古菌菌株TRM51T(a)和Halopiger aswanensis JCM 11628T(b)磷脂TLC 圖譜

3 討論

極端嗜鹽古菌屬于嗜鹽菌科，屬于生命三域中的古菌域［6，8］。本研究表明TRM51T革蘭氏陰性，可運動，菌株呈現粉紅色/白色，對數生長期細胞呈現長短不一的桿狀，NaCl 濃度為2.1～4.3 M，最適生長NaCl 濃度為3.1 M，不需要鎂離子即可生長，最適Mg2+濃度0.3 M，生長pH 6.0～7.0;根據16 S rDNA 系統發育分析TRM51T與Halopiger 屬［7］的同源性最高，達95.3%，確認為屬于嗜鹽菌科的一個新屬。

硝爾庫勒湖總鹽濃度接近于飽和狀態，前期的土樣分離工作中，得到了鹽堿球菌屬(Natronococcus)、鹽無色菌屬(Natrialba)、鈉白菌屬(Natrinema)、鹽東方菌屬(Halorientalis)、鹽陸生菌屬 (Haloterrigena)、鹽堿單胞菌屬(Natronomonas)、鹽池棲菌屬(Halostagnicola)、鹽惰菌屬(Halopiger)、鹽粒菌屬(Halogranum)7 個屬，34 株極端嗜鹽古菌，其中鹽堿球菌屬(Natronococcus)、鹽陸生菌屬(Haloterrigena)占的數量最多，菌落顏色呈現黃色、白色、紅色、橙色等，多數菌株有淀粉酶活性，少數有纖維素酶活性(文章另待發表)，有16 株潛在新種，菌株編號TRM51T就是一株。所有的分離的極端嗜鹽古菌的理化特征，更多酶活特點還在進行中。

本研究首次對該地區鹽湖的極端嗜鹽古菌進行了多相分類鑒定，是對該地區鹽湖微生物物種的資源的開發。該菌種資源可進一步作為微生物遺傳、生態和分類學等研究的材料，有一定的理論和應用價值。

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