白蓮腐敗病病原菌的分離鑒定

胡長志 ，孫曉棠 ，謝克強 ，蔣軍喜 ，鄭興汶 ，崔汝強

（1.江西農業大學農學院，南昌，330045；2.江西廣昌白蓮產業發展局）

白蓮（Nelumbo nuciferaGaertn）是一種水生經濟作物，在我國分布很廣，南北都有種植。改革開放后，特別是近些年來，我國子蓮產業發展迅速。據統計，全國子蓮種植面積10萬hm2以上，是我國種植面積最大的水生作物之一。蓮腐敗病是蓮種植區發生最普遍、為害嚴重的病害之一，在生長期和蓮藕貯藏期均可發病，分布廣闊，全國各蓮區均有發生[1]。蓮腐敗病屬土傳病害，病菌往往造成藕鞭、藕節、藕根腐爛，同時地上部分的葉、花也會萎蔫黃枯，發病嚴重的整株枯死[2]。

江西白蓮主產區每年有30%～70%的蓮發生蓮腐敗病，10%～15%的嚴重發生蓮腐敗病，顆粒無收，蓮農損失慘重。目前對該病害的致病機理、病害發生流行規律及有效的防治措施等鮮有報道，為病害的防治帶來了較大的困難。蓮腐敗病已成為阻礙白蓮產業持續發展的一大障礙。本試驗以廣昌發病白蓮為材料結合傳統的植物病原鑒定方法和分子生物學技術對該病害的病原菌進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病菌的分離鑒定

2011年7月從江西省廣昌縣采集具有典型白蓮腐敗病癥狀的病株，參照劉國安[2]的方法取病株蓮鞭、節和須根進行病菌分離，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）平板上28℃明暗12 h交替培養；待菌落生長后取先端菌絲進一步純化。觀察菌落形態、分生孢子產生及其形態和大小。

1.2 致病性測定

將純化的病菌于PSB液體培養基中培養制成10-6的孢子菌懸液針刺接種到蓮籽育出2 a生健康的蓮藕和蓮鞭上，蓮藕保濕24 h后栽回滅菌土中，蓮鞭于28℃光照培養箱中保濕；以無菌水為對照接種[2，3]。

1.3 DNA的提取

將分離的經致病性測定的病原菌采用PSA液體培養基在28℃120 r/min培養48 h后過濾收集菌絲，將菌絲轉移至滅菌的研缽中，用液氮將菌絲迅速研磨成粉末。采用CTAB法提取總DNA[4]。

1.4 ITS區段擴增分析

圖1 病原菌的致病性測定及形態光學照片

利用ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS 4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），以總 DNA為模板，進行擴增[4]。PCR 反應體系為：10×PCR Buffer2.5μL，10mmol/LeachdNTP0.5μL，ITS1（10 pmol）0.5 μL，ITS4（10 pmol）0.5μL，ddH2O 補足 25 μL。反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，54℃ 35 s，72℃1 min，30 個循環；72℃ 5 min；16℃保存。

取 PCR產物各 8 μL，0.6%瓊脂糖凝膠加5%Goldview染液，TAE緩沖液，100 V穩壓電泳50 min，用凝膠成像系統分析結果[5]。根據DL2000 Marker標準核酸中對應條帶位置推斷提取出的DNA分子量大小范圍。將回收的PCR產物連接至pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌JM109感受態，利用菌落PCR篩選陽性克隆，送至上海英濰捷基貿易有限公司測序。

1.5 同源性比對及系統發育分析

測序結果與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比對，確定與試驗菌株親緣關系最近的種屬。從GenBank數據庫獲得相關種屬的ITS區序列，利用MEGA 4.0軟件[6]構建系統發育進化樹，確定分離菌株的分類地位。序列對排用CLUSTAL X1.83 program[7]，進化樹的構建用Neighbour-joining方法。進化樹分支模式的穩定性用SEQBOOT和CONSENSE program進行bootstrap分析，重復次數為1 000，計算各分支的置信度[8]。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態鑒定

對引起廣昌白蓮腐敗病的病原物進行分離，并進行形態鑒定。病原物在PSA培養基上氣生菌絲早期為白色隨后變成深紫色，經明暗交替培養20 d后產生大小兩種孢子。大型分生孢子鐮刀形，無色，稍彎曲，兩端尖細，大小為（39.1～55.2）μm×（2.8～4.6）μm，多為 3個隔膜，少部分為 1～2隔或 4～5隔；小型分生孢子橢圓形，無色，無隔膜，大小為（5.0～9.2）μm×（2.0～3.5）μm；厚垣孢子球形，頂生或間生，單胞，直徑4.5～11.5 μm。初步鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.2 致病性測定結果

蓮鞭接種4 d后針眼處便有菌絲生長，10 d后將蓮鞭沿針眼處縱截面切開，可見接種點變褐腐爛（圖1A）；對照不發病。蓮藕接種后自然條件下60 d后可見典型病狀（圖1B）。

2.3 ITS區PCR擴增

采用通用引物ITS 1和ITS 4對其中致病性較強的 6 個菌株（F11-1、F11-2、F22-1、F32A、F23C和F23D）的ITS區 rDNA進行 PCR擴增，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并與標準分子量比較，結果顯示，均出現一條長度約為500 bp的擴增條帶（圖2），條帶特異性好。

2.4 ITS區域同源性比對

采用通用引物對6個菌株的ITS區rDNA進行PCR擴增后，對擴增產物進行克隆測序獲得500 bp的擴增產物。將獲得的序列與GenBank數據庫中已報道的序列進行Blast分析，6個菌株與已知尖孢鐮刀菌蓮專化型 （臺灣）Fusarium oxysporumf.sp.nelumbicola，F.oxysporumf.sp.rapae和F.oxysporumf.sp.raphani的同源性最高為98.7%～99.3%。6個菌株之間ITS序列同源性為99%以上。

2.5 系統發育學分析

將6個菌株的ITS區序列與同源性較高的相關種的ITS區構建系統發育樹（圖3），結果表明，從蓮上分離的6個菌株與尖孢鐮刀菌蓮專化型（DQ002550）及尖孢鐮刀菌其他專化型聚在一起構成一個分支，支持度為95%，進一步證明廣昌白蓮腐敗病病原菌為尖鐮孢菌蓮專化型。

3 結論與討論

尖孢鐮刀菌形態鑒定的重要特征是大孢子的形狀、大小以及隔膜的個數，而大孢子的產生需要一定的培養時間和相應的誘導條件，這為形態鑒定帶來了一定的困難。我們也一直在摸索便利的分子檢測鑒定的方法，rDNA ITS區受到的選擇壓力較小，進化速率較快。在絕大多數真核生物中表現出極為廣泛的序列多態性，已成為一種探求科內、屬內、種間的系統親緣關系及其物種鑒別的重要分子標記。利用這個片段開展的BLAST比對發現，NCBI上登錄了大量尖孢鐮刀菌的相應序列，長度500 bp左右，涵蓋了多個寄主專化型。這些信息對于利用該片段開展系統發育分析提供了便利[9]。該分子標記技術具有快速、準確、微量、靈敏度高、程序簡單等優點，現已廣泛應用于真菌的分類鑒定、檢測和病害診斷[10]。本研究結果為下一步蓮腐敗病檢測和防治工作的開展打下了基礎。

圖2 6個菌株ITS rDNA的PCR電泳擴增條帶

圖3 6個菌株ITS區系統發育進化樹

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