兩類醫用清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜去除效果的實驗研究

朱亭亭 李 濤 張流波

中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，北京 100021

醫用多酶清洗劑是一種含有蛋白水解酶等多種生物酶的清洗劑，能夠迅速有效地分解有機物如血液、蛋白質、黏多糖、脂肪及糖類，使蛋白質顆粒分離，懸浮顆粒易被流動水沖凈[1]。2004年頒布的《內鏡清洗消毒技術操作規范》 要求必須對內鏡采用多酶清洗劑進行清洗，這推動了國內多酶清洗劑的應用和推廣[2]。但是醫用多酶清洗劑與醫用不含酶清洗劑相比成本較高，國內對于這兩類清洗劑的清洗效果差異報道較少。為了了解兩類清洗劑的清洗效果差異，本研究采用生物膜反應器制備銅綠假單胞菌生物膜，利用活菌計數法進行了實驗研究。

材料和方法

材料

銅綠假單胞菌（ATCC15442），由中國科學院微生物所提供；CDC生物膜反應器，型號為CBR 90-1DH-Int，由美國Biosurface公司生產；試驗載體：聚碳酸酯小圓片，直徑1cm，厚度0.3cm；KQ-110E超聲波清洗器、DK-450B電熱恒溫水浴；培養基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）。

多酶清洗劑A（有效成分為發酵酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、細胞酶、表面活性劑,稀釋比例 1：126，中性pH值）；

多酶清洗劑B（有效成分為多酶—包含脂肪酶和蛋白酶的協同混合，稀釋比例1:100，中性pH值）；

多酶清洗劑C、多酶清洗劑D和多酶清洗劑E（有效成分為表面活性劑和多酶，稀釋比例1:100，中性pH值）；

不含酶清洗劑F（含有水，聚醚，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，二甲苯磺酸鈉，陰離子磷酸酯鉀鹽，乙二胺四乙酸四鈉，1,2-苯并異噻唑-3-酮，檸檬酸等，稀釋比例為1:630、低泡，pH中性）；

不含酶清洗劑G（是含有陰離子和非離子的清洗劑，稀釋比例1：375，pH值平衡配方）；

不含酶清洗劑H（非離子和兩性表面活性劑，丙二醇，氫氧化鉀，五水偏硅酸鈉，乙二胺四乙酸四鈉等，稀釋比例1:126，Ph值堿性）；

不含酶清洗劑I（是含有陰離子和非離子的清洗劑，稀釋比例1:757，pH值堿性）。

方法

1. 菌懸液配制

挑取24h新鮮斜面的3個～5個典型單個菌落，接種于100mL濃度為100mg/L的TSB中，于35℃±2℃條件下，振蕩培養20h～24h，使菌液濃度達到108CFU/mL。

2. 銅綠假單胞菌生物膜的制備

參考ASTM E 2562-07的制備方法[3]，選定特定材質的coupon，用超聲波清洗后用去離子水清洗，仔細安裝在反應桿上。向主反應器中加入500mL濃度為300mg/L的TSB溶液中，完成安裝反應器，置于121℃滅菌20min后冷卻備用。向主反應器中無菌加入1mL菌懸液后，打開磁力攪拌器，大約125r/min,溫度20℃±2℃培養24h。培養24h后，用無菌導管連接儲液罐、蠕動泵和廢液缸，儲液罐中為100mg/L的TSB溶液。打開蠕動泵，流速控制在11.7±0.2mL/min，流動培養24h（見圖1）。

3. 試驗操作步驟

圖1 生物膜反應器連接圖示

無菌條件下，取出培養好的載體片，用蒸餾水反復沖洗載體片表面浮游菌，然后將其放入含10mL清洗劑應用液的試管中，于40℃±2℃水浴中放置30min；將載體片取出，并將其放入含5mL0.85%NaCL洗脫液的試管中，于40KHz的超聲波清洗器中超聲15min后，進行細菌計數，此作為試驗組；對照組除用用蒸餾水代替清洗劑外，其余步驟與試驗組相同。

4. 除菌率的計算方法

除菌率（%）=（對照組菌落數-試驗組菌落數）×100%/對照組菌落數

結果

5種醫用多酶清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜的平均除菌率分別為9 1.3 3%、99.94%、99.94%、99.92%和96.07%（見表1）； 4種醫用不含酶清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜的平均除菌率分別為90.19%、99.87%、97.36%和92.51%（見表2）。運用統計軟件SPSS對兩組除菌率進行非參數檢驗分析，P=0.2683＞0.05，無顯著性差異。試驗結果表明，兩類清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜的去除效果沒有差異。

討論

本次試驗的研究結果表明，醫用多酶清洗劑和醫用不含酶清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜的去除效果沒有顯著性差異。結果分析如下：首先，本次試驗選用的兩類清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜均有顯著的去除效果，除菌率均大于90%。應當增加一些清洗效果相對偏差的醫用含酶清洗劑和醫用不含酶清洗劑以防止統計結果產生偏差。其次，生物膜是由細菌和自身分泌的胞外基質組成，活菌計數法評價兩類清洗劑對生物膜的去除效果即為兩類清洗劑的除菌率的不同，這一評價不能體現出多酶清洗劑對有機物分解的優勢，可見單一的活菌計數法在評價醫用多酶清洗劑對生物膜的去除效果方面存在不足，應當結合ATP生物熒光法、染色法、電鏡掃描等方法進行綜合評價。因此，為獲得理想的清洗效果，不同的污染物需要選擇不同類型的清洗劑。醫用多酶清洗劑的應用范圍和清洗效果有待進一步評價。

表1 5種醫用多酶清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜的去除率

表2 4種醫用不含酶清洗劑對銅綠假單胞菌生物膜的去除率

[1]張冬湘，黃琴香，莫云花等.消化內鏡多酶清洗的效果評價 [J].中國消毒學學雜志，2009，26（1）：76.

[2]中華人民共和國衛生部.內鏡清洗消毒技術操作規范[s].北京；中華人民共和國衛生部，2004.1-4.

[3]ASTM E 2562-07：Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC biofilm Reactor[s].2007.