趨化因子受體7(CXCR7)在食管鱗形細胞癌組織中的表達及其臨床意義

郭 晶 盧春來 古 杰 葛 棣

(復旦大學附屬中山醫院胸外科 200032 上海)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，病理學類型主要為鱗癌和腺癌。在我國，食管癌病理類型仍以鱗癌為主［1］。即使隨著手術技術、化療、放療等治療手段的不斷進步，食管癌患者的總體生存情況仍不樂觀，目前報道其5年生存率僅為30%［2］。造成這種局面的一個重要原因是食管癌較早且較易發生淋巴結及遠處轉移。因此，研究食管癌的生物學特點及尋找新的治療靶點已成為提高食管癌患者預后的關鍵。

趨化因子屬于細胞因子類蛋白超家族成員，能激活趨化因子受體并與之結合，從而在胚胎發育、血管生成、造血、炎癥、腫瘤和艾滋病等多種生理或病理過程中發揮重要作用［3］。目前，已發現至少50個趨化因子，根據其分子結構中氨基酸區域上半胱氨酸殘基的數量及空間排列不同將其分為4個亞型，即C、CC、CXC、和 CX3C［4－6］。自 Muller等［7］首次報道趨化因子受體(chemokine receptor，CXCR)和乳腺癌侵襲和轉移的關系之后，越來越多的趨化因子受體被發現與腫瘤有著密切的關系。CXCR4是其中一種重要的趨化因子受體，廣泛表達于多種腫瘤細胞表面，多項研究表明CXCL12/CXCR4信號軸在腫瘤轉移過程中起到非常重要的作用［8］。過去認為CXCR4是趨化因子CXCL12的唯一受體，然而最近研究發現CXCL12尚存在 CXCR7 這一新受體［9－10］，且 CXCL12/CXCR7 信號軸同樣可能在腫瘤發生發展中起重要作用。目前研究已經發現CXCR7在乳腺癌、肺癌、前列腺癌和惡性神經膠質瘤等多種腫瘤細胞中高表達，且與腫瘤的侵襲、轉移密切相關［11－14］。關于CXCR7在食管鱗形細胞癌中的表達，目前國內外尚無報道。本研究利用免疫組織化學染色法檢測胸段食管鱗癌組織標本中CXCR7的表達水平，探討CXCR7與食管鱗癌患者臨床病理特征及預后的關系。

資料和方法

研究對象 選取2006年在復旦大學附屬中山醫院胸外科行根治性手術的154例胸段食管鱗形細胞癌患者石蠟標本，同時選取49例正常食管鱗狀上皮組織標本進行對照。收集患者臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤分化程度、淋巴結轉移個數。pTNM分期參照食管癌UICC第7版分期。

病例一般情況 男性119例，女性35例;年齡38～85歲，平均年齡61．3歲，其中≤60歲76例，＞60歲78例;按腫瘤大小分組，＜3 cm 69例，≥3 cm 85例;按腫瘤浸潤深度分組，黏膜及黏膜下12例，侵犯肌層41例，侵犯食管外膜95例，侵犯食管周圍組織(T4a)6例;按腫瘤分化程度分組，高分化14例，中分化114例，低分化26例;按淋巴結轉移個數分組，無淋巴結轉移91例，＜3個淋巴結轉移44例，≥3個淋巴結轉移19例;按 pTNM分期(UICC第7版)分組，Ⅰ期(Ⅰa+Ⅰb)12例，Ⅱ期86例，Ⅲ期(Ⅲa+Ⅲb)52例，Ⅳ期4例(表1)。

隨訪情況 154例患者中，67例在術后接受了規則化療(鉑類+5-Fu，4～6周期)，無任何患者接受過術前新輔助化療或術后輔助性放療。隨訪至2011年12月31日，中位生存時間為40個月，最短隨訪時間2個月，最長隨訪時間71個月。

免疫組化 切片常規脫蠟至水，加入3%過氧化氫室溫孵育15 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS液洗，EDTA高溫修復抗原，滴加山羊血清，室溫孵育30 min后加入CXCR7鼠抗人單克隆抗體(IgG2a，clone 358426;R＆D system)，4℃ 冰箱孵育過夜，PBS漂洗后，滴加二抗室溫孵育30 min，PBS洗后，滴加三抗，室溫孵育，PBS液洗后于顯微鏡下 DAB顯色，蘇木精復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗做陰性對照。

結果判斷 CXCR7陽性結果判斷標準:細胞膜或胞質內出現淡黃至棕黃色染色為陽性細胞，隨機選取5個高倍鏡視野(×400)進行判斷。結果參照文獻報道［15］，陽性細胞范圍∶無陽性細胞，計0分，1% ～29%，計1分，30% ～59%計2分，≥60%計3分;染色強度∶陰性計0分，輕度染色計1分，中度染色計2分，強染色計3分;按陽性細胞范圍×染色強度評分，＜2分計為陰性，≥2分計為陽性。

表1 CXCR7表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系Tab 1 Analysis of the associations between CXCR7 expression and clinicopathologic features［n(%)］

統計學方法 采用SPSS 20統計軟件進行分析。不同分組間比較行χ2檢驗或Fisher精確檢驗。使用Kaplan-Meier法計算生存率，繪出曲線并進行Log-rank檢驗。多因素分析使用Cox風險比例模型評估分析與預后相關的獨立風險因素。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

食管鱗癌組織中CXCR7表達與患者臨床病理特征的關系 分析154例胸段食管鱗癌患者的組織標本，正常食管鱗狀上皮組織中CXCR7的陽性表達率為6．1%(4/49)，且表達均為弱陽性(圖1 A);在腫瘤組織中，CXCR7表達主要定位于細胞膜和細胞質內(圖1 B～D)，根據上述評分標準判斷:154例胸段食管鱗癌患者組織標本中CXCR7陽性116例(75．3%)，CXCR7 陰性 38 例(24．7%)。腫瘤組織中的CXCR7蛋白陽性表達率明顯高于正常食管鱗狀上皮組織，差異有顯著統計學意義(P＜0．01，表1)。CXCR7表達水平與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移及pTNM分期等具有明顯相關性(表2)，差異有顯著統計學差異(P＜0．01);而與患者年齡、性別、腫瘤生長部位、腫瘤分化程度及腫瘤大小無明顯相關性，差異無統計學意義(P＞0．05)。

圖1 CXCR7在食管正常鱗狀上皮組織及食管鱗狀細胞癌組織中的表達(×400)Fig 1 Immunohistochemical staining for CXCR7 in normal esophageal squamous epithelium and ESSC(×400)

表2 食管鱗癌患者預后的單因素及多因素分析Tab 2 Univariate and multivariate analysis of patients'survival

CXCR7表達水平與患者預后的關系 分析CXCR7的表達情況與患者無瘤生存期(disease free survival，DFS)及總生存期(overall survival，OS)的關系，隨訪截至日期2011年12月31日，154例患者中有88例患者術后發生復發或轉移，84例患者因腫瘤復發或轉移死亡，中位無瘤生存時間為29個月，總中位生存期為40個月。Kaplan-Meier曲線(圖2)顯示，CXCR7陽性表達組患者術后無瘤生存時間和總生存時間明顯低于CXCR7陰性表達組，差異有顯著統計學意義(P＜0．01)。

圖2 CXCR7表達與食管鱗癌患者術后無瘤生存期及總生存期的關系Fig 2 Kaplan-Meier analysis of disease-free survival and overall survival for patient suffering esophageal squamous cell carcinoma

單因素及多因素分析 單因素分析結果顯示性別、年齡、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、pTNM分期和CXCR7表達水平為食管鱗癌復發及轉移相關風險因素(P＜0．05)。多因素分析結果顯示腫瘤的pTNM分期和CXCR7表達水平為食管癌獨立不良預后因素(P＜0．05，表2)。

討 論

CXCR7又稱為 RDC-1，屬于 G蛋白偶聯受體，由362個氨基酸序列組成，基因定位于人染色體2q37。既往觀點認為CXCR4是CXCL12的唯一受體。然而，Balabanian等［9］在研究CXCL12趨化T淋巴細胞時，發現CXCL12能和RDC-1受體結合，且其趨化T淋巴細胞的作用可被RDC-1抗體所抑制。之后，Burns等［10］發現敲除 CXCR4基因的小鼠胎肝細胞仍可與CXCL12結合，進一步研究發現CXCL12結合的新位點就是RDC-1分子。并且RDC-1在氨基酸保守序列上與CXCR4具有相似性，同樣也是HIV的復合受體，故將其命名為CXCR7。由于其與CXCR4的相似性，故針對CXCR7在腫瘤發生發展過程中的作用也開始受到廣泛關注。

我們之前的研究發現CXCR4在食管鱗癌組織中呈高表達，且與患者的不良預后密切相關［16－18］。因此我們推測，作為CXCL12的另一高親和性受體CXCR7在食管癌中可能具有同CXCR4類似的作用。本次實驗運用免疫組織化學染色法檢測CXCR7在食管正常鱗狀上皮及食管鱗癌組織標本中的表達情況，并分析其與患者臨床病理特征之間的關系。我們發現，CXCR7陽性表達率在正常食管鱗狀上皮組織中低，而在食管鱗癌組織中高，且表達主要定位于腫瘤細胞的胞膜及胞質。這與早前的研究結果提示CXCR7表達于多種腫瘤細胞表面的結果一致［11－14］。目前的研究發現，CXCR7主要表達于轉化細胞或胚胎細胞表面，而極少表達于正常細胞［10］。

本次研究結果還發現，CXCR7的陽性表達與腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移個數與腫瘤的分期呈明顯相關性。這與我們之前關于CXCR4與食管鱗癌臨床病理特征相關性研究的結果一致［16－18］。CXCR7作為 CXCL12又一高親和性受體，主要通過與CXCL12的相互作用，參與腫瘤的增殖、抗凋亡、黏附、侵襲、轉移和血管生成等重要病理生理活動。Miao等［11］在一項體外實驗研究中發現，CXCR7的表達不僅促進乳腺癌及肺癌細胞的生長及血管生成，還促進乳腺癌細胞發生肺轉移。而Wang等［13］研究發現CXCR7可提高前列腺癌細胞的黏附及侵襲能力。多項研究還表明CXCR7可促進血管生成因子、IL-8及VEGF等細胞因子的分泌，從而促進腫瘤的血管新生［11］。

我們的研究還發現CXCR7陽性表達組的患者術后無瘤生存期和總生存時間均明顯低于CXCR7陰性表達組的患者。這一研究結果同CXCR7與肺癌［12］、膽囊癌［15］和腎癌［19］預后相關性研究的結果相一致。

盡管CXCR7的表達與腫瘤的增殖及轉移相關，但其具體作用機制仍不明確。體外實驗中，利用CXCL12刺激CXCR7可以促使CXCR7進入細胞膜，并以配體依賴途徑通過β抑制蛋白-2激活絲裂原活化蛋白激酶的級聯反應［20－22］。更有學者提出CXCR7只有與其他趨化因子受體形成二聚體后才能發揮作用［23－24］。Sierro 等［25］發現 CXCR7 在細胞內同CXCR4形成功能性異二聚體，這種異二聚體與SDF-1結合可以產生強烈的細胞內信號。

本次研究我們首次發現食管鱗癌組織中CXCR7表達水平與患者臨床病理特征及預后密切相關，推測CXCR7在腫瘤發生發展過程中起到重要作用。然而關于CXCR7在食管鱗癌中轉移的具體作用機制及信號通路則需要進一步的體內、體外實驗研究。

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