去整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)在喉癌組織中的表達和臨床意義

龐宇峰 周 梁 龔洪立 田 潔 龔靜蓉

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院耳鼻咽喉科 上海 200031;2復旦大學附屬上海市第五人民醫院耳鼻咽喉科 上海 200240)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，隨著工業化的進程與環境的污染，近40年來喉癌的發病率有逐漸增多的趨勢，但其病因與致病機制仍有待進一步探索，深入研究喉癌的發生發展與轉移等機制對患者的診斷治療及預后有著重要意義［1］。去整合素金屬蛋白酶家族(a disintegrin and metalloprotease 10，ADAMs)是一種近年來新發現的Ⅰ型跨膜蛋白家族，因其包含的兩個主要結構基質金屬蛋白酶區域與去整合素區域而得名。對ADAMs的逐步研究揭示這些分子廣泛參與了人體中諸如細胞黏附、融合、轉移，膜蛋白脫落和蛋白水解等生物學事件。研究還發現ADAMs在許多惡性腫瘤中有所表達，并參與了癌癥發生發展與轉移的病理過程［2］，其中ADAM10被發現在口腔鱗癌等腫瘤中有高表達［3］，但在喉癌中的表達國內外尚無相關研究報道。本研究采用實時熒光定量RT-PCR與組織芯片免疫組化的方法，研究ADAM10在喉癌中的表達及其與喉癌發生發展的相關性。

材料和方法

標本收集 收集復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院頭頸外科2011年1月至2011年4月的喉癌全喉切除術或部分喉切除術標本共21例。每例標本均取腫瘤組織及腫瘤周圍5cm以上的喉部正常黏膜組織，所有標本離體后均在10 min內置于液氮內保存待提取RNA。組織芯片所用標本收集于復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院頭頸外科2010年2月至2011年4月的喉癌全喉切除術或部分喉切除術標本共62例。每例標本均取腫瘤組織及腫瘤周圍5 cm以上的喉部正常黏膜組織，標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋待制組織芯片。

主要試劑及儀器 RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司);PrimeScript RT逆轉錄試劑盒，實時定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司);兔抗人ADAM10多克隆抗體(美國Abcam公司)。TMA600型博南組織芯片微陣列點樣儀(上海博南生物技術有限公司)。

實驗方法

實時熒光定量RT-PCR 引物的設計與合成:在GenBank中查詢并結合Primer Premier 6．0軟件設計ADAM10和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，作為內參)的引物，合成引物序列。ADAM10的擴增產物長度為 166 bp，其上游引物 5'-GCTGATGAGAAG-GACCCTACAA-3'，下游引物 5'-ATGCTCCAACCC-AAGCCAGAC-3'。總 RNA的提取:取組織塊50 mg用液氮在研缽中研磨成粉末，然后移入玻璃勻漿管中加入1mL Trizol抽打勻漿。然后按說明書步驟提取細胞內總RNA。用紫外分光光度儀測定RNA樣品濃度(D260/D280為1．8～2．0)。按照實時熒光定量RT-PCR的兩步法步驟分別進行反轉錄和PCR擴增。PCR的反應條件為:95℃變性1 min，然后 95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，進行 45個循環擴增。所有反應均設3個復孔，以GAPDH為內參照，記錄每個反應管中熒光信號所達設定閾值時的循環數即Ct值。采用2－ΔΔCt相對定量法，以GAPDH為內參，計算腫瘤組織及配對正常組織中ADAM10的相對表達量，ΔCt=Ct(ADAM10)－Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(腫瘤組織)－ΔCt(正常組織)。其中2－ΔΔCt表示腫瘤組織中 ADAM10的表達量相對于癌旁正常黏膜組織中ADAM10表達量的倍數。

組織芯片法 制片:(1)將62例10%甲醛溶液固定的標本石蠟包埋，顯微鏡下確定目標區并定位。(2)用陣列儀在標本蠟塊上打孔，鉆取標本組織柱，每個組織柱直徑1．5 mm，按順序移到受體蠟塊上，精確排成微孔陣列。然后將制備好的微陣列蠟塊放入溫箱，調定溫箱溫度，在半融狀態下取出。隨即冷卻并放入4℃冰箱中保存備用。(3)最后對組織芯片蠟塊連續切片。切片厚度2 μm，共切片100張。染色:一抗兔抗人 ADAM10多克隆抗體稀釋濃度1∶250。以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定:對染色的芯片分別進行照相。用計算機軟件分析組織芯片的每張圖片中的陽性面積(area)和陽性面積百分比(area%)以進行定量比較。

統計學處理 所有數據均采用Stata 9軟件處理，進行統計分析。其中數值采用表示，表達結果采用配對t檢驗，臨床參數分析采用單因素方差分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

ADAM10 mRNA的表達 通過實時熒光定量RT-PCR 方法檢測，經 2－ΔΔCt相對定量法分析，其中腫瘤組織中與正常黏膜組織中ADAM10的－ΔΔCt值見表1，由此測定ADAM10 mRNA在21例喉癌腫瘤組織與正常黏膜組織中表達的倍數(表1、圖1)。其相應的倍數為2．691 ±1．568，95%CI為1．978 ～3．405。對其倍數進行對數轉換，然后進行配對t檢驗，差異有統計學意義(t=5．633，P＜0．001)。說明喉癌組織中ADAM10的表達量高于正常黏膜組織。

圖1 實時熒光定量RT-PCR方法檢測ADAM10在腫瘤組織/對照正常組織中表達的倍數Fig1 The times of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by real time RT-PCR

表1 2－ΔΔCt方法計算 ADAM10(腫瘤/癌旁)相對表達量Tab 1 The times of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues calculated by 2 －ΔΔCtmethod

實時熒光定量RT-PCR檢測喉癌組織中ADAM10 mRNA的表達與臨床病理特征的關系 ADAM10在喉癌組織中的表達在不同的病理組織學分級中有差異(P＜0．01)。本次21組病例中有5例Ⅰ級(高分化)，16例Ⅱ級(中分化)，沒有Ⅲ級(低分化)病例。喉癌腫瘤組織與正常黏膜組織中ADAM10表達的倍數Ⅰ級明顯低于Ⅱ級，其中位表達值分別為Ⅰ級1．401、Ⅱ級2．826。此外，ADAM10 在喉癌組織中的表達在不同TNM分組、臨床分型、淋巴結轉移與否等各組中均無明顯統計學差異(表2、圖2)。

表2 ADAM10表達與喉癌臨床病理指標的關系Tab 2 Relationship between the expression of ADAM10 in laryngeal cancer and clinical or pathology parameters

組織芯片結果

圖2 實時熒光定量RT-PCR方法檢測ADAM10在腫瘤組織中與正常黏膜組織中表達倍數的臨床分類比較Fig 2 The times of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by real time RT-PCR，and showed by/as the clinical stage and the pathology grades

ADAM10蛋白的表達 ADAM10為跨膜蛋白，在人喉癌組織中主要表達于腫瘤細胞，陽性著色于細胞膜與胞質中，組織芯片照片見圖3。染色后對每對腫瘤組織與正常黏膜組織中陽性細胞面積百分比(area%)進行定量比較，比較其area%差值。經Stata軟件計算，ADAM10在喉癌組織中area%為15．243 ±7．824，ADAM10 在正常黏膜組織中area% 為 1．887 ±1．918，兩者差值為 13．356 ±8．430，95%CI為 11．215 ～ 15．497。進行配對 t檢驗，差異有統計學意義(t=12．474，P＜0．001)。說明組織芯片檢測喉癌組織中ADAM10的表達量高于正常黏膜組織(圖3、4)。

圖3 ADAM10蛋白在喉癌組織中(A、C、E、G)與正常黏膜組織中(B、D、F、H)的表達 (×200)Fig 3 The photos of ADAM10 expressed in tumor tissues(A，C，E，G)and control tissues(B，D，F，H)(×200)

組織芯片檢測喉癌組織中ADAM10蛋白的表達與臨床病理特征的關系 與實時熒光定量 RTPCR結果類似，ADAM10蛋白在喉癌組織中的表達在不同的病理組織學分級中有差異(P＜0．01)。本次62組病例中有10例Ⅰ級(高分化)，52例Ⅱ級(中分化)，沒有Ⅲ級(低分化)病例。喉癌腫瘤組織與正常黏膜組織中ADAM10表達的area%差值Ⅰ級明顯低于Ⅱ級，其中位表達值分別為Ⅰ級5．885、Ⅱ級 14．265。此外，ADAM10 在喉癌組織中的表達在不同TNM分組、臨床分型、淋巴結轉移與否等各組中均無明顯統計學差異(表2、圖5)。

圖4 組織芯片檢測腫瘤組織與正常黏膜組織中ADAM10的表達Fig 4 The difference of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by tissue chip

圖5 組織芯片檢測ADAM10在腫瘤組織與正常黏膜組織中表達差值比較的臨床分析Fig 5 The difference of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by tissue chip，and showed by Clinical stages and pathology grades

討 論

1989年科學家在牛髓鞘堿性蛋白水解酶研究中發現了ADAM10，因發現其具有與ADAMs家族相似的結構與功能，故命名之［2］。目前將ADAM家族成員分為兩組:跨膜型ADAM和分泌型ADAMTS(帶凝血酶敏感蛋白模體的ADAM)。ADAM家族成員多含有共同的前肽段，由金屬蛋白酶區域、去整合素區域、表皮生長因子樣區域、跨膜區和細胞質區域組成［4］。近年，ADAMs家族引起了科學家的廣泛關注，它們的功能不斷得到研究。ADAMs是一種有多個功能區域的蛋白，不同的功能區域各司其職。它不僅參與其他膜蛋白的蛋白水解過程，同時也參與了細胞黏附與細胞信號傳導。ADAMs的金屬蛋白酶區域的功能如同一把“剪刀”，能特異性地剪切許多膜蛋白酶底物。諸如許多生長因子如表皮生長因子、轉化生長因子α、肝素結合表皮生長因子以及細胞因子如腫瘤壞死因子α等，所有這些蛋白在合成時需要從相應的前體一步步水解才能轉化為不同的生物功能結構。許多研究顯示ADAMs廣泛參與這些蛋白的水解，同時包括許多受體(如腫瘤壞死因子 α受體Ⅰ、Ⅱ，CD44，L-選擇素和 Erb4/HER4等)在細胞膜表面的胞外脫落也有賴于ADAMs的剪切作用。通過這一過程，ADAMs廣泛參與細胞的信號傳導，從而影響腫瘤的發生發展［2］。ADAMs的另一個功能是作為整合素的配體與基質蛋白競爭。另外，ADAMs的富半胱氨酸域可以通過形成如多配體聚糖和纖維連接蛋白而達到細胞黏附功能［5］。

許多研究已經證明ADAMs參與了腫瘤的發生與增值，而ADAM10也被發現在許多腫瘤細胞和腫瘤組織中有高表達［2］。近年的研究證實ADAM10的過表達能促進口腔鱗狀細胞癌和胃癌的生長，同樣發現通過干擾ADAM10使之表達下調可使腫瘤細胞減緩增殖，所以ADAM10被認為是腫瘤治療的新的潛在靶點［2－3］。本研究通過實時熒光定量RTPCR與組織芯片的方法，分別從基因與蛋白的層面檢測了ADAM10在喉癌中的表達情況。研究表明喉癌組織中ADAM10 mRNA與ADAM10蛋白較正常黏膜組織的表達量均有上升(P＜0．001)，提示ADAM10參與了喉癌的病理進展。這與ADAM10在胃癌、卵巢癌、子宮內膜癌、結腸癌、前列腺癌等不同組織中的表達狀況基本相同［6－9］。通過臨床參數的分析發現，RT-PCR與組織芯片方法均提示ADAM10的表達與喉癌組織學分級明顯相關(P＜0．01)。雖然本次研究未有組織學分級Ⅲ級的病例，影響了實驗結果的完整性，但仍能提示ADAM10的表達與腫瘤的分化程度相關，其表達隨腫瘤的惡性程度增加而上調。這也同Ko等［3］在口腔鱗癌中檢測ADAM10的表達結果一致。另據文獻報道ADAM10可通過釋放激活L1細胞黏附分子(L1-CAM)來加強卵巢和子宮腫瘤細胞的轉移能力。L1-CAM是一種神經細胞黏附分子，在許多腫瘤細胞中也有表達，它可參與黑色素瘤、肺癌等腫瘤的轉移與侵襲，而ADAM10被視作是這些細胞系主要的L1脫落酶，從而促進腫瘤的轉移［10－11］。本次研究中實時熒光定量RT-PCR與組織芯片方法均提示ADAM10的表達與TNM分期、是否淋巴結轉移、腫瘤臨床分型無明顯相關。這一結果與文獻不盡相同，所以關于ADAM10同腫瘤轉移的關系還有待深入研究。

綜上所述，本研究結果顯示ADAM10在喉癌組織中有高表達，但本研究只是ADAM10與喉癌關系的初步探究，并未涉及其參與癌癥發展的具體機制探索，有待于進一步研究明確。

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