Midkine(MDK)在肝細胞癌(HCC)中的表達及其臨床意義

朱文偉 張巨波 郭 磊 張 博 葉青海

(復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所肝外科 上海 200032)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，預后很差，5年生存率不到5%，排在我國癌癥死因第2位［1］。HCC預后差的一個重要原因就是多數患者未能早期發現、早期診斷和早期治療。一旦出現癥狀，多數患者已進入中晚期，往往失去根治性治療的機會，故療效很差。因此，尋找新的腫瘤標記物以進一步提高HCC患者的早期診斷率是進一步改善其預后的關鍵。我們課題組前期通過基因芯片分析技術發現5個在HCC癌組織中高表達的基因(GPC3、PEG10、MDK、SERPINI1 和 QP-C)，并發現運用這5個基因可以準確區分肝癌組織及肝硬化的肝組織［2］。

其中，Midkine(MDK)為一種小分子分泌性蛋白，屬肝素結合生長因子家族成員，其相對分子質量(Mr)約為14 000［3］。MDK基因定位于人類染色體11p11．2，由5個外顯子和4個內含子構成。MDK是一種重要的多功能細胞因子，最初發現其在多種系統和組織、特別是神經系統的發生和發育中起著重要作用。深入研究還發現MDK在多種腫瘤中表達顯著上調［4－8］。它可通過促進細胞的惡性轉化、促進腫瘤血管生成、促纖溶和細胞趨化、增強腫瘤細胞的耐藥性和抑制細胞凋亡等一系列作用［4］以調節腫瘤的發生、發展、轉移、耐藥等不良生物學行為。但關于MDK在HCC患者組織以及血清中的表達未見深入報道。本文旨在以前期工作為基礎，進一步探討MDK在HCC患者組織中的表達。同時，通過檢測肝癌患者血清 MDK水平，初步分析其作為HCC檢測指標的臨床價值。

材料和方法

組織及血清樣本 收集2005年期間在我院肝外科行根治性手術的50例臨床樣本，其中HCC患者的腫瘤組織30例，其對照石蠟標本20例。20例對照中，10例正常肝組織來源于血管瘤患者，10例無瘤肝硬化組織來源于門脈高壓患者行斷流手術時的活檢肝組織。此外，課題中所使用的總共120例血清樣本(包括60例肝癌、20例乙肝肝硬化、19例丙肝肝硬化及21例正常人血清標本)分別來自2005年9月至2007年2月在復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所經外科手術切除后并經病理學證實的肝癌患者及中山醫院消化科和上海市公共衛生中心臨床診斷為肝硬化的患者。正常人血清標本來源于中山醫院健康體檢中心體檢正常的血清標本。病理診斷由2位病理學專家共同認定，所有患者均簽署知情同意書。

細胞株及試劑 實驗中所用的各種細胞系(LO2、Changliver、PLC、HepG2、Hep3B、MHCC97H、HCCLM3)由我院肝癌研究所構建或保存。Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，Takara逆轉錄及實時定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)，DMEM高糖培養基(美國Gibco BRL公司)，MDK抗體(美國Lifespan Bioscience公司)，GAPDH、羊抗兔抗體(美國 Cell Signaling Technology公司)，Envision二抗(丹麥DAKO公司)，MDK ELISA試劑盒(美國BioVendor公司)。

細胞培養 復蘇的細胞采用DMEM高糖培養基(含10%FBS，青霉素200 IU/mL、鏈霉素200 IU/mL)于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。0．25%胰蛋白酶 +0．02乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)消化細胞，1∶3 傳代，約3～4天傳代1次。

免疫組化染色 切片常規脫蠟至水，以3%的過氧化氫靜置10min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS液沖洗，經抗原微波修復后以MDK抗體(稀釋濃度1∶250)孵育4℃過夜，之后以 Envision二抗37℃孵育30 min，DAB顯色液，蘇木精復染，封片。以PBS緩沖液代替一抗，其他步驟不變，結果作為陰性對照。

Western blot 樣品準備:細胞長至瓶底的80%～90%時，棄去培養液向培養瓶中加入相應體積的蛋白裂解液裂解細胞，0℃放置15 min。用刮棒刮下細胞，收集到預冷的1．5 mL離心管中;在4℃下12 000 r/min離心20 min，將上清按需分裝，保存于－80℃;BCA法檢測蛋白濃度，100℃蛋白變性5 min。制備聚丙烯凝膠，室溫下60 V電泳至分離膠與濃縮膠分界線后，電壓轉至80 V繼續電泳約2 h。安裝轉膜裝置，冰浴轉膜:100 V/1～2 h。用5%脫脂奶粉室溫下封閉 1 h;加一抗(MDK、GAPDH)雜交，PBST洗膜3次，每次10 min;加二抗(山羊抗兔)雜交，PBST洗膜3次，每次10 min。顯影:混合ECL試劑(每張膜用試劑A與試劑B各1mL)。瀝干膜，迅速加上混合液，輕輕搖晃，反應70 s，以保鮮紙包裹，貼入暗盒。Las3000曝光機器曝光，根據膜顯影情況，適度調節曝光時間。

酶聯免疫吸附反應(ELISA) 血清MDK檢測嚴格按照MDK ELISA檢測試劑盒的產品說明書進行。每個樣品做2個復孔，酶標儀上讀出450 nm波長時各孔的吸光度值(D)。酶標儀根據平板設置、每孔吸光度值以及標準曲線自動計算每孔的濃度，根據標準品精確計算出樣品濃度(ng/mL)。

數據處理 用SPSS 17．0統計軟件進行統計學分析。不同組間計量資料的比較用配對t檢驗;計數資料分別計算例數和所占比例，構成情況間的差別用χ2檢驗或Fisher's確切概率法。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

MDK在肝癌組織、肝硬化組織及正常肝臟組織中染色表達情況 MDK主要表達于肝癌腫瘤組織中，呈彌漫性分布于細胞質;同時亦有少部分散在表達于肝硬化組織的膽管上皮細胞內，而在正常肝細胞內幾乎不表達(圖1)。MDK在各組織中的表達及統計情況見表1。MDK在肝癌組織中的表達顯著強于肝硬化組織及正常肝組織。在30例腫瘤組織標本中，23例呈陽性表達(陽性率77%)，表達陽性率顯著高于肝硬化組織(3/10，30%;P＜0．01)和正常肝組織(0/10，0%;P＜0．001)。

圖1 MDK在肝癌、肝硬化及正常肝組織中的表達Fig 1 Expression of MDK in HCC tissue，cirrhotic liver tissue and normal liver tissue

表1 MDK在肝癌、肝硬化及正常肝組織的表達差異Tab 1 MDK expression levels in HCC，cirrhotic liver and normal liver tissues

MDK在各種肝癌細胞系和正常肝細胞系中的表達 通過Western blot檢測各種細胞株中MDK的蛋白表達水平變化(圖2)，在兩株正常肝細胞系LO2和Chang liver中未能檢測到MDK蛋白表達，而在肝癌細胞系 PLC、HepG2、Hep3B、MHCC97H、HCCLM3中MDK蛋白普遍表達，尤其在MHCC97H細胞中表達最高。

圖2 MDK不同肝癌細胞系中的表達Fig 2 MDK expression in different cell lines

血清MDK在HCC患者、肝硬化患者和正常人群中的表達 為了進一步明確MDK能否作為HCC血清標記物，我們采用ELISA法檢測60例HCC患者和60例對照人群的血清MDK表達情況。ELISA檢測發現，除了2例正常人外，其余受試者血清中均能檢測到MDK。各組血清標本的MDK水平檢測結果如圖3所示。HCC患者血清中 MDK 的中位數水平(1．195 ng/mL，0．84～1．71)較正常人(0．102 ng/mL，0．02 ～0．53;P＜0．01)、HBV 相關肝硬化(0．57 ng/mL，0．26 ～0．67;P＜0．05)和 HCV 相關肝硬化(0．34 ng/mL，0．09 ～0．56;P＜0．01)患者顯著升高。我們進一步通過ROC曲線評估MDK診斷HCC的敏感性和特異性。結果發現，血清MDK的ROC曲線下面積(AUROC)高達 0．918，95%CI為 0．866～0．966(P＜0．001，圖 4)，提示血清檢測MDK可以區分肝癌患者和非肝癌患者。

圖3 肝癌、肝硬化和正常人中血清MDK表達水平Fig 3 Expression of serum MDK in patients with HCC and liver cirrhosis as well as health donors

圖4 血清MDK蛋白水平的ROC曲線Fig 4 ROC curve of serum MDK

血清 MDK在甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)陰性肝細胞癌和小肝癌患者中的表達情況如圖5所示，在60例肝癌患者中，AFP陰性(＜20 ng/mL)的肝癌患者血清MDK水平(1．597 ng/mL，1．01 ～2．08)同樣顯著高于正常人水平(0．102 ng/mL，0．02 ～0．53;P＜0．001)及肝硬化患者(P＜0．001)。另一方面，我們還進一步分析了MDK在小肝癌患者(＜5 cm)患者中的表達情況。結果同樣發現，MDK在小肝癌患者中表達水平(1．168 ng/mL，0．802～1．899)亦顯著高于上述對照人群。以上結果提示，血清MDK在診斷AFP陰性肝癌和小肝癌中具備初步的臨床價值。

圖5 MDK在小肝癌和AFP陰性肝癌中的表達水平Fig 5 Expression of serum MDK in small HCCs and AFP negative HCCs

討 論

據統計，70%～90%的肝細胞癌患者常合并存在慢性肝病和肝硬化，其主要致病因素為HBV和HCV感染［9－10］。從20世紀70年代肝癌患者血清內被檢測到特異性AFP升高以來，AFP作為肝癌診斷標志被廣泛運用。但是只有60%～70%的肝癌患者血清存在AFP升高(＞20 ng/mL)，小肝癌患者更是只有33% ～65%伴血清AFP升高。而且，15% ～58%的慢性肝炎患者和11%～47%的肝硬化患者(肝癌高危人群)均發現血清AFP的非特異性升高，而75% ～90%的肝癌發生在硬化的肝臟［11］。因此，尋找新的特異性及敏感性更高的肝癌標志物，對肝癌尤其是AFP陰性肝癌的診斷具有重要意義。

我們課題組前期通過基因芯片分析技術對218例不同AFP水平的肝癌患者的癌組織及癌旁組織基因表達譜比較分析，得到5個在癌組織中高表達的基因(GPC3、PEG10、MDK、SERPINI1 和 QP-C)，同時運用這5個基因可以準確地將肝癌組織和肝硬化的肝組織區分開［2］。且在AFP陰性肝癌和小肝癌患者中的診斷預測準確率分別達到82%和87．5%，其中尤以GPC3、PEG10和MDK所占的預測權重較大［2］。本研究中，我們在前期研究的基礎上，選取其中的一個重要候選基因MDK進一步觀察其蛋白水平在HCC腫瘤組織、肝硬化組織和正常肝組織中的表達情況。我們證實，MDK不僅在HCC組織中表達顯著上調，而且在各種肝癌細胞系中也普遍表達。

MDK是肝素結合生長因子的成員之一［3］，最初是在視黃酸誘導的胚胎腫瘤細胞中發現該基因的表達。與同為肝素結合生長因子家族成員類似，MDK具有包括促纖溶、抗凋亡、促有絲分裂、細胞轉化、血管形成和化學趨化功能，參與多種腫瘤發生［4］。作為一種分泌性蛋白質，MDK存在于多種腫瘤患者血清中［12－13］。Ikematsu 等［14］發現多種腫瘤患者血清中MDK水平升高，其中87%的患者超過0．5 ng/mL，顯著高于對照組的(0．154 ±0．076)ng/mL。提示血清MDK可作為檢測HCC的一種重要手段。和既往在胃癌的研究報道類似［15］，本實驗檢測結果發現在大部分正常人、所有肝硬化及HCC患者的血清中均可檢測到MDK蛋白，而HCC患者血清MDK較正常人、HBV相關肝硬化和HCV相關肝硬化患者顯著升高。ROC曲線評估MDK診斷HCC的敏感性和特異性發現，血清MDK的ROC曲線下面積(AUROC)高達0．918，95%CI為 0．866 ～0．966(P＜0．001)，血清檢測MDK可以區分肝癌患者和非肝癌患者。提示血清MDK是檢測HCC的潛在腫瘤標記物。有趣的是，我們的初步結果還發現，在AFP陰性(＜20 ng/mL)肝癌和小肝癌(＜5 cm)患者中，MDK的表達同樣明顯升高，不僅初步提示其在AFP陰性HCC患者中的診斷價值，而且提示將兩者聯合檢測有望進一步提高HCC診斷的靈敏性。

綜上所述，本研究結果證實MDK在HCC中的表達及其在HCC發生中的重要作用，也為臨床治療肝癌提供了潛在的靶點。此外我們推測，血清檢測MDK可能成為診斷肝癌特別是AFP陰性肝癌的重要血清標志物。因此進一步擴大肝細胞癌血清樣本驗證其在HCC中的診斷價值十分必要。

［1］ Yang L，Parkin DM，Ferlay J，et al．Estimates of cancer incidence in China for 2000 and projections for 2005［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14(1):243 －250．

［2］ Jia HL，Ye QH，Qin LX，et al．Gene expression profiling reveals potential biomarkers of human hepatocellular carcinoma［J］．Clin Cancer Res，2007，13(4):1133 － 1139．

［3］ Muramatsu T．Midkine(MK)，the product of a retinoic acid responsive gene，and pleiotrophin constitute a new protein family regulating growth and differentiation［J］．Int J Dev Biol，1993，37(1):183 －188．

［4］ Kadomatsu K，Muramatsu T．Midkine and pleiotrophin in neural development and cancer［J］．Cancer Lett，2004，204(2):127－143．

［5］ Rha SY，Noh SH，Kwak HJ，et al．Comparison of biological phenotypes according to midkine expression in gastric cancer cells and their autocrine activities could be modulated by pentosan polysulfate［J］．Cancer Lett，1997，118(1):37－46．

［6］ Garver RJ，Radford DM，Donis-Keller H，et al．Midkine and pleiotrophin expression in normal and malignant breast tissue［J］．Cancer，1994，74(5):1584 －1590．

［7］ O'Brien T，Cranston D，Fuggle S，et al．The angiogenic factor midkine is expressed in bladder cancer，and overexpression correlates with a poor outcome in patients with invasive cancers［J］．Cancer Res，1996，56(11):2515 －2518．

［8］ Sakitani H，Tsutsumi M，Kadomatsu K，et al．Overexpression of midkine in lung tumors induced by N-nitrosobis(2-hydroxypropyl)amine in rats and its increase with progression［J］．Carcinogenesis，1999，20(3):465 －469．

［9］ El-Serag HB，Rudolph KL．Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis ［ J］．Gastroenterology，2007，132(7):2557 －2576．

［10］ Poon D，Anderson BO，Chen LT，et al．Management of hepatocellular carcinoma in Asia:consensus statement from the Asian Oncology Summit 2009［J］．Lancet Oncol，2009，10(11):1111－1118．

［11］ Taketa K．Alpha-fetoprotein:reevaluation in hepatology［J］．Hepatology，1990，12(6):1420 －1432．

［12］ Obata Y，KikuchiS，Lin Y，etal．Serum midkine concentrations and gastric cancer［J］．Cancer Sci，2005，96(1):54－56．

［13］ Shimada H，Nabeya Y，Tagawa M，et al．Preoperative serum midkine concentration is a prognostic marker for esophageal squamous cell carcinoma［J］．Cancer Sci，2003，94(7):628－632．

［14］ Ikematsu S，Yano A，Aridome K，et al．Serum midkine levels are increased in patients with various types of carcinomas［J］．Br J Cancer，2000，83(6):701 －706．

［15］ Xu Y，Qu X，Zhang X，et al．Midkine positively regulates the proliferation of human gastric cancer cells［J］．Cancer Lett，2009，279(2):137 －144．