柱前衍生化HPLC法測定注射用氨磷汀的含量

黃滔敏 陳念祖 王東蕾 賴永華 王勝資

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院藥劑科，2放療科 上海 200031)

氨磷汀(阿米福汀，amifostine，又稱WR-2721)，化學(xué)名S-2-［3-氨丙基胺］乙基硫代磷酸，結(jié)構(gòu)式為NH2-(CH2)3-NH-(CH2)2-S-PO3H2，原是冷戰(zhàn)期間美國Walter-Reed陸軍研究所合成的4 000余種放射保護(hù)劑中最有效的防護(hù)核輻射藥物，也是美國FDA批準(zhǔn)上市的第一個泛細(xì)胞保護(hù)劑，即廣譜的選擇性細(xì)胞保護(hù)劑。它能選擇性保護(hù)正常器官免受化療、放療的毒性攻擊而不保護(hù)腫瘤組織，因此能明顯改善患者對化療、放療的耐受性，提高其生活質(zhì)量。1999年被美國FDA批準(zhǔn)用于對抗化療藥腎毒性以及減輕腫瘤患者因放療引起的口干癥［1］。

目前，文獻(xiàn)報道的氨磷汀的含量測定方法有電化學(xué)測定［2－3］、化學(xué)發(fā)光［4］和 HPLC 熒光胺柱前衍生化法［5］。電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光檢測法雖靈敏度較高，但易于受到雜質(zhì)及其他物質(zhì)的干擾。熒光胺柱前衍生化法雖靈敏度較高，但需要用熒光檢測器。氨磷汀結(jié)構(gòu)本身并不具有強的發(fā)光基團(tuán)，其HPLC直接紫外測定法檢測波長在210 nm附近，選擇性不高且易受到流動相及溶劑性質(zhì)的影響。我們采用FMOC-Cl對氨磷汀衍生化后，其衍生化產(chǎn)物在普遍使用的紫外檢測器即可進(jìn)行測定，且測定時流動相配制簡單，為乙腈和水的混合溶液，該反應(yīng)簡便、快速且適用性更廣。

材料和方法

儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國惠普公司，包括 G1322A Degasser在線脫氣、G1311A QuartPump四元泵、G1316A Column柱溫箱、G1314A VWD紫外檢測器、惠普色譜工作站及20 μL手動進(jìn)樣系統(tǒng));B5500s-MTH超聲波清洗器(上海Branson超聲波儀器廠);Mettler Toledo SevenEasy型pH計(梅特勒－托利多儀器有限公司);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，Sartorius，d=0．1 mg)。

試藥 乙腈(HPLC純，美國Tedia公司);注射用氨磷汀(大連美羅大藥廠，批號 53101001，53110201;規(guī)格:0．4g/瓶);氨磷汀對照品(美國藥典對照品標(biāo)準(zhǔn)，批號:F0F075);氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl，F(xiàn)luka，批號:WB11080，含量≥99%);三蒸水(本實驗室自制)。

色譜條件 色譜柱:Agilent C18(150 mm×4．6 mm，5 μm);流動相 A:乙腈，B:水。0 ～4 min，A∶B=30∶70;4．1 ～10 min，A∶B=98∶2，每次進(jìn)樣前再平衡7 min;柱溫25℃;流速1 mL/min;檢測波長265 nm;進(jìn)樣量 20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液配制 精密稱取氨磷汀標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，加水溶于25 mL量瓶中，配制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

供試品溶液配制 精密稱取適量注射用氨磷汀(約相當(dāng)于氨磷汀0．05 g)置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液適量，用水稀釋100倍，作為注射用氨磷汀供試品溶液(約50 μg/mL)。

樣品預(yù)處理 取氨磷汀供試品溶液100 μL，加乙腈 100 μL，加硼酸緩沖液(0．2 mol/L，pH=8．0)100 μL，加衍生化試劑 FMOC-Cl(8 mmol/L乙腈溶液)100 μL，漩渦混勻30 s，置于暗處反應(yīng)15 min，加甘氨酸(0．1 mol/L)20 μL 終止反應(yīng)，漩渦 30 s，進(jìn)樣 20 μL。

空白試驗和專屬性 照上述色譜條件，將空白輔料溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液，供試品溶液分別經(jīng)“樣品預(yù)處理”處理后，進(jìn)樣20 μL，色譜圖見圖1。氨磷汀衍生化產(chǎn)物保留時間約為2．6 min。

圖1 空白樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和供試品色譜圖Fig 1 Chromatograms of blank，standard and test samples

結(jié) 果

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用水稀釋配成 5、10、20、50、75、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“樣品預(yù)處理”項下操作。用衍生化產(chǎn)物峰面積(A)與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為 y=34．233 7x+11．213 9(r=0．999 9，n=6)。

檢測限 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，測得氨磷汀最低檢測質(zhì)量濃度為100 ng/mL(γS/N=3)。

回收率 空白輔料中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成5、50、100 μg/mL 的氨磷汀溶液，按“樣品預(yù)處理”項下操作測定回收率(表1)。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery test (n=5)

精密度 用標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成10、50、100 μg/mL的氨磷汀溶液，按“樣品預(yù)處理”項下操作測定，連續(xù)進(jìn)樣用作日內(nèi)精密度，連做5天作為日間精密度，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果Tab 2 Results of precision test (n=5)

溶液穩(wěn)定性 供試品溶液每隔3 h進(jìn)樣1次，結(jié)果表明6 h內(nèi)可獲得穩(wěn)定的測定結(jié)果，RSD=0．93%(n=3)。

重復(fù)性 取同一批樣品按樣品測定方法測定5次，求得RSD為1．35%，表明本法重現(xiàn)性良好。

樣品的含量測定 取供試品溶液，按“樣品預(yù)處理”項下操作測定。測得兩批樣品中氨磷汀含量為標(biāo)示量的99．1%和98．0%。

討 論

氨磷汀沒有共軛基團(tuán)，因而缺乏紫外及熒光吸收，其含量難以用紫外或熒光檢測器直接測定，需要將其衍生化后進(jìn)行檢測。文獻(xiàn)報道的氨磷汀的含量測定方法有電化學(xué)測定、化學(xué)發(fā)光法和HPLC熒光胺柱前衍生化法。電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光檢測法雖靈敏度較高，但易于受到雜質(zhì)及其他物質(zhì)的干擾。熒光胺柱前衍生法雖靈敏度較高，但需要用熒光檢測器，而熒光檢測器不如紫外檢測器應(yīng)用廣泛。

FMOC－Cl作為衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化后可用HPLC法測定。本研究中對不同的衍生化條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)緩沖液在pH 8．0時可以得到最高的響應(yīng)值。FMOC-Cl的濃度為8 mmol/L時，反應(yīng)時間達(dá)15 min，即可達(dá)到穩(wěn)定的響應(yīng)值。衍生化溶液中維持乙腈和水的比例大約為1∶1是必要的，因為乙腈濃度過高，氨磷汀和緩沖液成分會不溶而析出沉淀，而濃度過低，衍生化試劑又會析出。

本法中氨磷汀最低檢測質(zhì)量濃度為100 ng/mL(γS/N=3)，靈敏度高，可以探索應(yīng)用于體內(nèi)氨磷汀的檢測。

［1］ Kouvaris JR，Kouloulias VE，Vlahos LJ．Amifostine:The First Selective-Target and Broad-Spectrum Radioprotector［J］．The Oncologist，2007，12(6):738 －747．

［2］ Bai F，Kirstein MN，Hanna SK，et al．New liquid chromatographic assay with electrochemical detection for the measurement of amifostine and WR1065 ［J］．J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2002，772(2):257 －265．

［3］ Bolner A，Barbato L，Tagliaro F，et al．Determination of apomorphine in human plasma by alumina extraction and highperformance liquid chromatography with electrochemical detection［J］．Forensic Sci Int，1997，89(1 －2):81 －91．

［4］ 郁豐善，蔡蘋，陳芳．化學(xué)發(fā)光法測定氨磷汀研究［J］．分析科學(xué)學(xué)報，2008，24(2):149 －152．

［5］ 孫偉光，盧婷利，陳濤，等．高效液相色譜-熒光胺柱前衍生法測定氨磷汀微球中氨磷汀的含量［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(14):1189 －1192．