載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)促進單核細胞源性巨噬細胞產生前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)

王維娜 朱海燕 黃 海 葉 麗 馮美卿

(復旦大學藥學院生物合成教研室 上海 201203)

研究顯示，載脂蛋白A-Ⅰ (apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ)作為人血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的主要蛋白質成分和功能執行者，不但是預測動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的理想指標，還可以通過抗炎、抗血栓形成、血管保護、參與膽固醇逆轉運和斑塊重塑等過程來發揮抗AS的作用［1－2］。由于長期服用傳統抗AS藥物有嚴重的不良反應，相比之下作為一種人體內固有蛋白的apoA-Ⅰ可能會更加安全，并為AS的治療帶來新的希望，具有廣闊的應用前景。單核細胞源性巨噬細胞是一種在AS的發生發展中起關鍵作用的細胞，它產生的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)具有舒張血管和抑制血小板聚集的作用;前列腺素D2(PGD2)具有抑制炎性因子和炎性細胞黏附以及抑制血小板聚集的作用;前列腺素D合酶(lipocalin type prostaglandin D synthase，L-PGDS)是促進PGD2合成的關鍵酶［3－5］。PGE2和 PGD2的這些生理功能均有利于抑制AS的發生和發展。目前，國內外關于apoA-Ⅰ抗AS具體機制的研究主要集中在apoA-Ⅰ對炎性過程中相關炎性因子的影響以及對膽固醇逆轉運過程的影響等。而apoA-Ⅰ 的抗AS作用及其與PGE2和PGD2之間的相關性研究尚未見報道。我們設想apoA-Ⅰ 可能通過影響PGE2和PGD2的合成來發揮抗 AS作用。本研究觀察了apoA-Ⅰ 對THP-1細胞源性巨噬細胞產生L-PGDS、PGE2和PGD2的影響，探討它們與 apoA-Ⅰ 抗 AS作用之間可能的關系。

材料和方法

實驗材料 人單核細胞株THP-1細胞(中國科學院上海細胞庫);apoA-Ⅰ(實驗室畢赤酵母表達);佛波酯(phorbol esters，PMA，美國Alexis公司);RMPI 1640培養基和FBS(美國Cibco公司);四甲基偶氮唑藍MTT(美國Sigma公司);總RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(加拿大Fermentas公司);Taq酶(上海申能博彩生物科技有限公司);ELISA試劑盒(美國RND公司)。

實驗方法

細胞培養及處理 人單核細胞株THP-1細胞接種于含 10%FBS、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的新鮮RPMI1640培養基，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養箱中培養。細胞培養至濃度為1×105/mL～1×106/mL時可傳代。取對數生長期的THP-1懸浮細胞，換用含有100 ng/mL佛波酯的全培養基，以細胞數1×106/mL、每孔2 mL接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱內培養。24～48 h后，THP-1細胞誘導為呈貼壁生長的巨噬細胞。細胞按實驗要求分組，分別用無血清培養液和含 apoA-Ⅰ12．5、25、50、100 和 200 μg/mL的無血清培養液孵育24 h。

細胞毒性試驗(MTT法)確定給藥濃度 取對數生長期THP-1細胞，換用含有100 ng/mL佛波酯的全培養基，接種于96孔培養板(細胞數為5×105/mL，每孔200 μL)培養24～48 h后得到巨噬細胞。巨噬細胞分別換用無血清培養液和含apoA-Ⅰ12．5、25、50、100 和 200 μg/mL 的無血清細胞培養液孵育，每孔200 μL。24 h后，每孔加人MTT溶液(5 g/L)20 μL繼續培養4 h，棄去孔內培養基，每孔加入 150 μL DMSO，37℃溫搖 10 min，使其充分溶解。用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度值(D)，計算經不同濃度apoA-Ⅰ孵育細胞的存活率。

RT-PCR檢測L-PGDS mRNA的表達 用Trizol一步法分別提取經不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育24 h的THP-1細胞源性巨噬細胞總RNA。具體操作如下:用細胞刮刀消化細胞后，PBS洗2次，1 000 r/min離心5 min收集于EP管中，加入l mL Trizol混勻，室溫放置5 min后加入氯仿0．2 mL，劇烈振搖，室溫放置3 min，于4℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液至EP管中，加入0．5 mL異丙醇，混勻后放置于室溫10 min，4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清即可見RNA沉淀。加入DEPC水處理過的75%乙醇l mL混勻，4℃、7 500 r/min離心5 min后棄上清，自然晾干。加入20 μL DEPC水溶解RNA，－80℃保存備用。總RNA經純度及濃度檢測后用逆轉錄試劑盒按說明書操作得到cDNA。采用Primer 5軟件設計PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。PCR反應條件:95℃ 預變性5 min;95℃ 變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環;72℃延伸10 min。擴增產物經1．2%瓊脂糖凝膠電泳分析并用凝膠成像設備拍照，圖片用Image Quant TL軟件分析，以L-PGDS和GAPDH表達量的比值來表示L-PGDS mRNA表達的相對水平。

表1 RT-PCR引物Tab 1 The primers used for RT-PCR amplification

ELISA檢測PGE2和PGD2蛋白的表達 THP-1細胞源性巨噬細胞經不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育24 h后，取細胞上清液用ELISA試劑盒檢測PGE2和PGD2蛋白的表達量。具體操作如下:(1)建立標準曲線:設標準孔8孔，1～7孔每孔中各加入稀釋到適當濃度的標準品50 μL，第8孔為空白對照。每個標準品和空白做3個復孔。(2)加樣:在每個反應孔中加入細胞培養上清50 μL。每個樣品做3個復孔。(3)立即加入50 μL的生物素標記的抗體，蓋上蓋板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。(4)每孔中加入60 μL親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。(5)每孔中加入底物工作液 A、B 各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃ 溫育 10 min。避免光照。(6)取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，在450 nm波長處測定各孔的D值。(7)數據處理:各測定的D值減去空白孔D值，為測試實際D值。以標準品濃度為橫坐標，D值為縱坐標，得出標準曲線。根據每個測定樣品的實際D值在該曲線圖上查出各自含量。

統計學分析 應用SPSS 11．5統計分析軟件，計量數據以表示，兩組間均數的比較用t檢驗進行分析，多組之間均數的比較采用One-Way ANOVA進行分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

不同濃度apoA-Ⅰ 對巨噬細胞細胞毒性的影響THP-1細胞源性巨噬細胞經不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育 24 h 后，用 MTT 法檢測不同濃度時細胞的存活率，每個樣本重復3次，取平均值。結果顯示:分別經 12．5、25、50、100、200 μg/mL apoA-Ⅰ孵育的THP-1細胞源性巨噬細胞與不經apoA-Ⅰ處理的細胞相比，細胞存活率僅略微下降。apoA-Ⅰ濃度為200 μg/mL時細胞存活率可達到98．4%，可以排除apoA-Ⅰ細胞毒性對實驗結果的影響(圖1)。與對照組相比，除12．5、25 μg/mL 兩組差異無統計學意義(細胞存活率均接近100%)，其他3組差異均有統計學意義(P＜0．001)。

圖1 不同濃度apoA-Ⅰ對THP-1細胞源性巨噬細胞存活率的影響Fig 1 Cellular toxicity of apoA-1 in macrophages

apoA-Ⅰ 對L-PGDS mRNA表達的影響 用Image Quant TL軟件分析GAPDH和L-PGDS的電泳圖片，以目的基因L-PGDS與內參GAPDH含量的比值來表示L-PGDS mRNA表達的相對水平，每個樣本重復3次，取平均值。結果顯示:分別經12．5、25、50、100和200 μg/mL apoA-Ⅰ孵育的 THP-1細胞源性巨噬細胞與不經 apoA-Ⅰ處理的細胞相比，L-PGDS mRNA的相對表達量分別提高7．192%、18．944%、66．991%、49．406%和48．582%，各組間差異均有統計學意義(P＜0．001)。且當apoA-Ⅰ的濃度為50 μg/mL時，提高 L-PGDS mRNA表達作用最明顯(圖2)。

apoA-I對PGE2和PGD2蛋白表達的影響THP-1細胞源性巨噬細胞經不同濃度(0、12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育 24 h 后，用 ELISA方法檢測細胞上清液中PGE2和PGD2的蛋白含量，每個樣本重復3次，取平均值。結果顯示:經12．5、25、50、100 和 200 μg/mL apoA-Ⅰ處理的巨噬細胞與對照組(apoA-Ⅰ0 μg/mL)相比，PGE2的蛋白表達量分別提高 20．006%、25．421%、32．948%、4．886% 和2．198%(圖 3);PGD2的蛋白表達量分別提高24．553%、29．831%、48．954%、18．072% 和15．224%(圖4)，各組間差異均有統計學意義(P＜0．001)。且當apoA-Ⅰ的濃度為50 μg/mL時，提高PGE2和PGD2蛋白表達作用最明顯(圖2)。

圖2 不同濃度apoA-Ⅰ誘導的THP-1細胞源性巨噬細胞中L-PGDS mRNA的表達Fig 2 The L-PGDS mRNA expression in macrophages derived from THP-1 cells was determined by RT-PCR after the cells were treated with apoA-Ⅰ

圖3 不同濃度apoA-Ⅰ誘導的THP-1細胞源性巨噬細胞中PGE2蛋白的表達Fig 3 The PGE2content in cultured supernatant was determined with ELISA after the macrophages were incubated with apoA-Ⅰfor 24 h

圖4 不同濃度apoA-Ⅰ誘導的THP-1細胞源性巨噬細胞中PGD2蛋白的表達Fig 4 The PGD2content in cultured supernatant was determined with ELISA after the macrophages were incubated with apoA-Ⅰfor 24 h

討 論

AS是心腦血管事件發生的共同基礎，是造成心腦血管疾病和死亡的重要因素，其發病機制十分復雜且相互交織，有關學說甚多。其中炎性反應學說對AS的發生發展過程解釋的較為全面，被認為是AS發生和發展的核心機制，炎性因子參與了AS從發生到發展以及惡化的所有過程［6－7］。

長期服用臨床上常用的抗AS藥物存在著嚴重不良反應，亟待找到安全、有效、不良作用小的抗AS藥物。由于apoA-Ⅰ是人體內HDL的主要蛋白質成分，安全、不良作用小的優點使其開發前景十分誘人。關于HDL的抗AS作用及其機制的研究報道已經很多，因此apoA-Ⅰ抗AS的機制研究越來越受到大家的關注。研究表明［8－9］:apoA-Ⅰ在將膽固醇由外周組織轉運到肝中代謝的膽固醇逆轉運(reverse cholesterol transport，RCT)過程中發揮關鍵作用。apoA-Ⅰ可以顯著抑制AS的進展，apoA-Ⅰ的長期穩定表達能夠延緩AS的進展，并使斑塊重塑到穩定的表型。apoA-Ⅰ可能通過其抗炎、抗血栓形成和內皮功能保護等多種作用抑制AS的發生和發展。但是目前關于apoA-Ⅰ抗AS具體作用機制的研究還有待完善，還有很多方面需要深入研究。

近年來，花生四烯酸及其代謝產物與AS病變的發生、發展及其與血管保護因子作用機制間的關系越來越受到關注。環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是催化花生四烯酸產生前列腺素H2(prostaglandin H2，PGH2)的限速酶，后者在不同酶的催化下合成各種前列腺素類(prostaglandin，PG)產物，如在前列腺素E合成酶-1(type 1 membrane PGES，mPGES-1)催化下生成PGE2;在L-PGDS催化下生成PGD2等。PGE2和PGD2是單核巨噬細胞花生四烯酸代謝的兩種重要產物。研究顯示［10］，PGE2可防止血管內皮細胞損傷，抑制SMC增殖;增強內皮依賴性舒張功能，改善血凝纖溶失衡，抑制血小板聚集和血栓形成;并且對抗氧化應激從而抑制DM性AS發生發展。近期有文獻表明PGE2還可以促進巨噬細胞內膽固醇酯水解和膽固醇排出，抑制膽固醇在細胞內積聚;還可能參與巨噬細胞對粥樣斑塊穩定性的調節［11］。PGD2能抑制炎性細胞和炎性因子的黏附，并阻止血小板凝集［12－13］。因此PGE2和PGD2的生理功能有利于對AS的抑制。關于apoA-Ⅰ對PGE2和PGD2表達的影響以及它們與apoA-Ⅰ抗AS作用的關系尚未見報道。所以我們觀察了apoA-Ⅰ對參與AS的一種重要細胞即巨噬細胞表達PGE2和PGD2的影響，并探討它們與apoA-Ⅰ抗AS作用的關系。

本研究結果表明，與不經apoA-Ⅰ孵育的THP-1細胞源性巨噬細胞相比，經不同濃度(12．5、25、50、100、200 μg/mL)apoA-Ⅰ孵育 24 h 后，巨噬細胞合成及釋放PGE2和PGD2的水平顯著提高，同時巨噬細胞中L-PGDS mRNA的表達水平也顯著提高。當apoA-Ⅰ 濃度為 50 μg/mL時，其提高 L-PGDS mRNA表達及促進PGE2和PGD2產生的作用最明顯。

本實驗證明，apoA-Ⅰ可以顯著上調THP-1細胞源性巨噬細胞中 L-PGDS mRNA及PGE2、PGD2蛋白的表達。我們認為apoA-Ⅰ增加PGD2蛋白表達的作用是通過增加L-PGDS表達而實現的。促進產生的PGE2和PGD2可以分別發揮自身的抗AS和血管保護作用。所以，我們認為apoA-Ⅰ 除了可以通過已經報道的一些作用機制發揮抗AS作用外，還可能通過增加PGE2和PGD2的表達來發揮抗AS的作用。此過程中可能還涉及復雜的調控機制，我們會進一步深入研究。

［1］ Wang L，Chen WZ，Wu MP，et al．Apolipoprotein A-Ⅰinhibits chemotaxis，adhesion，activation of THP-1 cells and improves the plasma HDL inflammatory index［J］．Cytokine，2010，49(2):194 －200．

［2］ Pedersen TX，Bro S，Andersen MH，et al．Effect of treatment with human apolipoprotein A-Ⅰon atherosclerosis in uremic apolipoprotein-E deficient mice［J］．Atherosclerosis，2009，202(2):372－381．

［3］ Moore KJ，Tabas I．Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis［J］．Cell，2011，145(3):341 －355．

［4］ Saleem S，Shah ZA，Urade Y，et al．Lipocalin-prostaglandin D synthase is a critical beneficial factor in transient and permanent focal cerebral ischemia［J］．Neuroscience，2009，160(1):248－254．

［5］ Cipollone F，CicoliniG，BucciM．Cyclooxygenase and prostaglandin synthases in atherosclerosis:Recent insights and future perspectives［J］．Pharmacol Ther，2008，118(2):161－180．

［6］ Patel S，Celermajer DS，Bao S．Atherosclerosis-Underlying inflammatory mechanisms and clinical implications［J］．Int J Biochem Cell Biol，2008，40(4):576 －580．

［7］ Di Tarantoa MD，Morgante A，Bracaled UM，et al．Altered expression of inflammation-related genes in human carotid atherosclerotic plaques［J］．Atherosclerosis，2012，220(1):93－101．

［8］ Rocco AG，Sensi C，Gianazza E，et al．Structural and dynamic features of apolipoprotein A-I cysteine mutants，Milano and Paris，in synthetic HDL［J］．J Mol Graph Model，2010，29(3):406－414．

［9］ Zhang Q，Liu L，Zheng XY．Protective roles of HDL，apoA-I and mimetic peptide on endothelialfunction:through endothelial cells and endothelial progenitor cells［J］．Int J Cardiol，2009，133(3):286 －292．

［10］ Smith JP，Haddad EV，Downey JD，et al．PGE2 decreases reactivity of human platelets by activating EP2 and EP4［J］．Thromb Res，2010，126(1):e23 － e29．

［11］ Linton MF， Fazio S．Cyclooxygenase products and atherosclerosis［J］．Cardiovasc Dis，2008，5(1):25 － 36．

［12］ Inoue T，Eguchi Y ，Matsumoto T，et al．Lipocalin-type prostaglandin D synthase is a powerful biomarker for severity of stable coronary artery disease［J］．Atherosclerosis，2008，201(2):385－391．

［13］ Tanaka R，Miwa Y，Mou K，et al．Knockout of the l-pgds gene aggravates obesity and atherosclerosis in mice［J］．Biochem Bioph Res Commun，2009，378(4):851 －856．