組織學切片法在三維重建大鼠海馬結構中的應用價值

季達峰 孫李穎 宋佳敏 王 鳴 張 通 呂廣明

（南通大學醫學院人體解剖學系 南通 226001）

對生物體內部顯微結構的三維重建是近年來醫學形態學和組織工程學的一大熱點。對細微生物結構重建并利用三維打印技術（3Dprint technology，TPT）可將生物體內的顯微空間結構顯示出來，其方法有影像學和組織學兩種。影像學方法多用于脈管系統或骨骼的三維重建［1］而不適用于鼠腦微觀結構的三維重建和顯示，組織學方法可以通過特異染色和顯微拍攝的方法對目標顯微結構進行三維重建。目前已對大鼠海馬結構進行了大體的三維重建和可視化［2］，但組織學方法因其重建耗時長且程序要求高，國內外較少通過此方法重建。

為了探索如何通過組織學方法方便、快速和準確地重建生物體內顯微結構，本實驗通過組織學切片、尼氏染色和顯微拍攝，根據大鼠腦立體定位圖譜對海馬分區，利用可靠性較高的3DDOCTOR 4．0軟件對大鼠海馬結構進行三維可視化重建，計算出各區及側腦室體積。

材料和方法

實驗動物 健康、成年SD大鼠3只，由南通大學實驗動物中心提供，雄性，體重250g，取全腦至脊髓頸1節段后固定。

大鼠腦冠狀及矢狀面切片 SD大鼠2只，取腦干標本在德國Leica冰凍切片機上行冠狀面冰凍連續切片，片厚30μm，進行直接貼片，每張玻片貼6張切片，每只大鼠共獲得連續切片269張，切得每只大鼠腦標本8 070μm。1只大鼠全腦行正中矢狀面切片，片厚30μm。

尼氏染色、顯微拍攝和圖像處理 氯仿浸泡30 min，70%、95%、100%酒精各處理1min，蒸餾水洗滌30s，焦油紫浸泡10min，70%酒精處理1min，蒸餾水洗滌30s，二甲苯處理10min，中性樹脂封片。

切片排列后在正置顯微鏡下用5倍物鏡進行拍攝，依據腦片大小分為4～5個視野不等。所得照片在Photoshop 7．0軟件中進行拼接處理，并統一大小為3 000×3 000像素，正中矢狀切片也以尼氏染色后在5倍光鏡下顯微拍攝，所得照片進行拼接后大小為3 000×3 000像素。

三軸法［3］是基于物體三維特性而衍生出的對齊方法，在冠狀面切片時標本的冠狀面均已對齊。取半只大腦標本，在矢狀面上可以利用切面對齊（圖1A），再利用正中矢狀切面的高低點對應算出每張切片所要上下移動的距離作為水平面對齊的標準。

三維重建和可視化 所得圖像排序和對齊完成后導入3D－DOCTOR 4．0軟件［4］中，根據大鼠腦立體定位圖譜，以手工方式將切片中海馬劃分為CA1、CA2、CA3和DG 4區，并標記出側腦室位置（圖1B），然后用簡單渲染和復雜渲染分別對重建模型進行渲染，利用軟件自帶工具對不同目標結構的表面積、體積進行計算。渲染結果以bmp文件格式保存圖像，三維模型以3ds文件輸出，以便導入3DMAX 8．0軟件中進行對稱化處理和進一步渲染。

結 果

經3DMAX 8．0軟件渲染后大鼠海馬結構整體、海馬內細胞及側腦室三維可視化結果如圖2海馬內各區的重建及三維可視化結果如圖3。

圖1 所得照片以三軸法對齊并根據大鼠腦立體定位圖譜進行定位分區Fig 1 Photographs aligned via three－axes locating system and districted according to stereoscopic atlas of rat brain

圖2 海馬體，細胞帶，側腦室以及整體的各面觀Fig 2 Different aspects of lateral ventricles and the body and cells of hippocampus

圖3 大鼠海馬結構各分區的三維重建Fig 3 3Dreconstruction of four parts of hippocampus

大鼠側腦室、海馬結構及其各區（CA1、CA2、CA3、DG、cell）的位置、體積及表面積 簡單渲染和復雜渲染下海馬各區體積最大的均為CA1區，其次為DG區，最小為CA2區；中心最外為CA2區，最內為DG區（表12 各區占海馬整體百分比最大的為CA1區，最小為CA2區，相加后簡單渲染總數為70．99% 復雜渲染總數為72．36% 表3)。

表1 大鼠側腦室、海馬結構及其各區的體積、表面積及位置Tab 1 Volume，area and location of lateral ventricle and hippocampus

表2 大鼠側腦室、海馬結構及其各區的體積、表面積及位置Tab 2 Volume，area and location of lateral ventricle and hippocampus

表3 大鼠海馬結構中各區占海馬總體積的比例Tab 3 The proportions of four parts （%）

討 論

近年來隨著醫療事業的不斷進步，對阿爾茨海默病［5－6］（Alzheimer disease，AD）病因的研究逐漸深入，我們發現腦內海馬結構的病變與AD的發生有密切關系，對腦內海馬結構的研究也逐漸成為熱點。

海馬是齒狀回外側、側腦室下角底壁上的弓狀隆起，與齒狀回構成海馬結構［7］。依據細胞形態及皮質發育的差異，海馬被分為CA1、CA2、CA3及DG4個扇形區。海馬結構參與海馬回路的構成，該環路與情感、學習和記憶等高級神經活動有關［8］。

目前對海馬結構的研究已深入到內部細胞類型［9］和 CA1a、CA1b、CA1c等亞結構［2］。但對于大鼠海馬的空間結構及各亞區的位置關系了解甚少，三維重建和可視化技術［2］可以對目標內部結構做全面的了解，并在電腦上生動直觀地顯像，某些三維軟件還可以對這些結構進行量化測量。因而利用該技術對組織結構進行可視化的實驗已經廣泛開展，但在采集二維圖像等具體方法的選用上不盡相同。目前最常用的是影像學技術，如螺旋CT［10］、DSA、MRI［11］（主要用于血管病變的三維重建以確定血管病變的部位和大小）等，這些方法較為快捷方便。

本課題組在三維重建和可視化方面做過深入的研究［12－13］，對組織學方法進行三維重建和可視化的實驗步驟和方法比較了解。考慮到標本分部切片時中間過渡組織會有磨損，本實驗采用全腦冰凍后連續切片和直接貼片，尼氏染色［14］后在光學顯微鏡下直接對切片攝片，通過Photoshop 7．0對照片進行拼接并以三軸法配準。染色采用神經系統最常用的尼氏染色法，其染色方法成熟，灰白質區分能力強，可大批量染色。通過計算機圖形軟件處理，參照大鼠腦立體定位圖譜對照片中的海馬進行分區。3DDOCTOR是一款常用的醫學三維重建軟件，重建方法簡單，結果可靠，并帶有測算面積和體積的工具。

本實驗利用3D－DOCTOR4．0軟件手動勾勒出海馬整體以及各區的邊界，重建出大鼠海馬整體及各區結構，在不同的渲染條件下利用軟件自帶計算工具計算出各分區及側腦室的體積、表面積，再計算出各區占海馬整體的百分比［2］。在重建后的體積百分比計算中我們也發現各區百分比相加后在70%至73%之間，一方面是由于在勾勒各區邊界時有些區域被忽略，另一方面由于渲染時會對勾勒區進行網格光滑而“磨損”掉一些區域。但隨著渲染的復雜度提高，“磨損”區的比例會逐步下降，所以在復雜渲染中各區相加的百分比略高于簡單渲染的結果。

本研究結果表明，利用組織學方法可以對大鼠腦內海馬結構及其各區進行三維可視化重建；利用3D－DOCTOR4．0軟件可以對重建的海馬各區計算體積。

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