食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Netrin-1的表達(dá)*

劉宗文，王文娟，田薇薇，梁 冰，楊家梅，劉 萍，張鈺浩，張 艷

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453000 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001

Netrin-1是一種層黏連相關(guān)的分泌性蛋白，可以調(diào)控細(xì)胞的存活和其受體家族DCC(deleted in colorectal cancer)以及UNC-5H(uncoordinated-5-homolog)的活性，從而在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用[1]。目前，許多研究[2-3]表明，Netrin-1與結(jié)腸癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。然而，迄今為止，尚未見關(guān)于Netrin-1與食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的研究報(bào)道。為了初步闡明Netrin-1在ESCC組織中的表達(dá)情況，該研究利用原位雜交技術(shù)和免疫組化方法檢測(cè)ESCC組織和正常食管黏膜組織中Netrin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，旨在以Netrin-1為靶點(diǎn)探討ESCC的發(fā)生機(jī)制，并為食管癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料40例ESCC手術(shù)切除標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科2008年9月至2010年6月的手術(shù)存檔蠟塊，同時(shí)另取40例正常食管黏膜組織作為對(duì)照，所有病例在手術(shù)前均未接受任何形式的治療，包括放療、化療和免疫治療。ESCC組中男27例，女13例；年齡43～81(58.2±11.7)歲。對(duì)照組中男29例，女11例；年齡38～77(55.8±8.5)歲。40例ESCC組織中組織學(xué)分化程度Ⅰ級(jí)18例，Ⅱ級(jí)10例，Ⅲ級(jí)12例；浸潤(rùn)深度達(dá)淺層者(淺肌層及其以上)22例，深層者(深肌層及其以下)18例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期17例。上述所有標(biāo)本經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋和連續(xù)切片(厚度4～6 μm)，分別用于免疫組化和原位雜交染色。兔多克隆抗體Netrin-1購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。原位雜交5’端生物素標(biāo)記、全硫代修飾探針由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，探針序列5’-CTCCACGCAGTGCCGCAAGA-3’。

1.2免疫組化及原位雜交方法免疫組化采用PV9000法，Netrin-1抗體稀釋倍數(shù)為1150，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。原位雜交切片經(jīng)新鮮配制的二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)0.5% H2O2室溫處理30 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；體積分?jǐn)?shù)3%檸檬酸新鮮配制蛋白酶(0.01 g/L)，37 ℃ 10 min，消化標(biāo)本DNA結(jié)合蛋白；每張玻片滴加20 μL不含Netrin-1探針的預(yù)雜交液(42 ℃)，預(yù)雜交4 h；加含探針(1 mg/L)的雜交液，42 ℃濕盒內(nèi)雜交 12～16 h；0.1×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(SSC)42 ℃洗后，加SA-Bio-AP,37 ℃ 10 min；漂洗后加BCIP/NBT顯色劑，避光顯色0.5～2.0 h。

1.3結(jié)果判斷Netrin-1蛋白陽(yáng)性信號(hào)均呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。Netrin-1 mRNA陽(yáng)性信號(hào)呈紫藍(lán)色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下選取5個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè))，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定[4-5]。①按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分：0分，細(xì)胞無(wú)顯色；1分，淺黃色(淺藍(lán)色)；2分，棕黃色(藍(lán)色)；3分，棕褐色(紫藍(lán)色)。②按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，<30%為1分，30%～70%為2分，>70%為3分。取2項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總積分，0～1分為陰性(-)，≥2分為陽(yáng)性(+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。ESCC和正常食管黏膜組織中Netrin-1陽(yáng)性表達(dá)率的比較、不同病理學(xué)特征ESCC組織中Netrin-1陽(yáng)性表達(dá)率的比較均采用χ2檢驗(yàn)，ESCC組織中Netrin-1蛋白及mRNA表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析采用Pearson列聯(lián)系數(shù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1ESCC和正常食管黏膜組織中Netrin-1的表達(dá)Netrin-1蛋白及mRNA陽(yáng)性表達(dá)均位于細(xì)胞質(zhì)中，蛋白陽(yáng)性信號(hào)呈淺黃色至深黃色，mRNA陽(yáng)性信號(hào)呈不同程度紫藍(lán)色顆粒(圖1)。結(jié)果見表1。

圖1 正常食管黏膜(A、C)和ESCC組織(B、D)中Netrin-1蛋白和mRNA的表達(dá)(×200)

組織類型nNetrin-1蛋白Netrin-1 mRNAESCC4019(47.5)21(52.5)正常食管黏膜402(5.0)2(5.0)χ218.66022.029P<0.001<0.001

2.2Netrin-1表達(dá)與ESCC病理學(xué)特征的關(guān)系結(jié)果見表2。

表2 Netrin-1蛋白及mRNA表達(dá) 與ESCC病理學(xué)特征的關(guān)系 陽(yáng)性例數(shù)(%)

2.3ESCC組織中Netrin-1蛋白及mRNA表達(dá)的關(guān)系結(jié)果見表3。

表3 ESCC組織中Netrin-1蛋白及mRNA表達(dá)的關(guān)系 例

rP=0.517,P<0.001。

3 討論

Netrin是首次在秀麗隱桿線蟲中篩選調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的蛋白時(shí)被鑒定[6]。在哺乳動(dòng)物中，5個(gè)Netrin基因已經(jīng)被鑒定，包括Netrin-1、3、4、G1和G2。其中Netrin-1、3、4為分泌型，而Netrin-G1和G2能夠通過(guò)羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇尾錨錠于質(zhì)膜上[7-8]。Netrin-1的C結(jié)構(gòu)域，也被稱為Netrin樣單元，為具有多種不同生物學(xué)功能的一些相似的結(jié)構(gòu)域，具有高度的同源性。分泌型Netrin(Netrin-1、3、4)的C結(jié)構(gòu)域不需要結(jié)合于受體DCC或UNC-5同源物上[9-11]。UNC-6的C結(jié)構(gòu)域在線蟲中的缺失產(chǎn)生軸絲導(dǎo)向缺失，但與完全的UNC-6功能缺失相比，其作用相對(duì)較小[12]。Netrin-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Delloye-Bourgeois等[13]研究發(fā)現(xiàn)，92例非小細(xì)胞肺癌組織中43例表達(dá)Netrin-1，其陽(yáng)性表達(dá)率為47%，表明Netrin-1可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外，與人類非轉(zhuǎn)移乳癌不同的是，Netrin-1在轉(zhuǎn)移的乳癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者中比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者中的表達(dá)量顯著提高，大約31.5%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的乳癌患者中Netrin-1的表達(dá)水平至少提高5倍[14]。在卵巢癌的研究[15]中發(fā)現(xiàn)17例卵巢癌組織中有13例呈現(xiàn)Netrin-1的陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為76.5%，但是在正常組織中尚未發(fā)現(xiàn)Netrin-1的表達(dá)。這些研究表明Netrin-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，因而有望成為腫瘤治療的新的分子靶點(diǎn)。

該研究結(jié)果顯示，40例ESCC組織中21例(52.5%)呈現(xiàn)Netrin-1 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)，高于正常食管黏膜組織的陽(yáng)性表達(dá)率5.0%。此外，蛋白表達(dá)分析結(jié)果顯示，40例ESCC組織中19例(47.5%)呈現(xiàn)Netrin-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，也高于正常食管黏膜組織的陽(yáng)性表達(dá)率5.0%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Netrin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均與患者的組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。另外ESCC組織中Netrin-1蛋白與mRNA的表達(dá)有關(guān)聯(lián)。這提示Netrin-1 mRNA和蛋白可能在ESCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的探討。

該研究結(jié)果提示，Netrin-1在ESCC組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)可能在ESCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究ESCC組織中Netrin-1的分子調(diào)控機(jī)制有望為以Netrin-1為靶點(diǎn)的ESCC的診斷和治療提供理論依據(jù)。

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