杜氏鹽藻葉綠體轉化載體pUC-chlN 1622-CAT的構建*

張匯征，崔柳青，潘衛東#，薛樂勛

1)鄭州大學微生物學與免疫學教研室 鄭州 450001 2)河南工業大學生物工程學院 鄭州 450001 3)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室 鄭州 450001

杜氏鹽藻是單細胞雙鞭毛的真核綠藻，行光合自養，其僅含有的一個大型杯狀葉綠體占自身體積的50%，適合于葉綠體轉化系統的建立。外源基因轉入葉綠體基因組是通過同源重組的機制定點整合完成的，雙交換形式葉綠體同源重組載體的構建是關鍵。該研究的同源片段是以chlN基因及其上下游序列構建于外源基因的兩側，目的在于：轉入鹽藻葉綠體后的載體，可以同源重組定點整合的方式插入到葉綠體基因組，確保外源基因插入后可穩定遺傳。其中的chlN基因，可與chlB、chlL基因一起共同編碼光非依賴性的原葉綠素酸酯還原酶，該酶廣泛存在于以葉綠素為光合色素的生物中，并主要參與了黑暗條件下葉綠素的合成，破壞任一個基因(chlN、chlB、chlL基因)都會阻斷黑暗條件下葉綠素的合成。但是鹽藻可通過光依賴性的原葉綠素酸酯還原酶在光照條件下進行葉綠素的合成，使得藻株的正常生長不受影響。實驗選擇來自原核生物的氯霉素乙酰轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因和已被證實在鹽藻葉綠體內具有轉錄活性的衣藻葉綠體啟動子aptA和終止子rbcL為調控序列，構建理論上較理想的杜氏鹽藻葉綠體雙交換轉化載體pUC-chlN 1622-CAT，使它在具有原核性質的鹽藻葉綠體系統中能夠順利表達。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株、載體和藻株 大腸桿菌DH5α為鄭州大學細胞生物學研究室保存，含CAT表達盒(以aptA為啟動子、rbcL為終止子)的載體pSP71-aptA-CAT由該室構建。野生型杜氏鹽藻CCAP19/18購于CCAP(Culture Collection of Algae and Protozoa)公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 各種限制性內切酶、T4 DNA聚合酶、pMD18-T載體等均購自寶生物工程(大連)有限公司，凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司，氯霉素購自上海生物工程有限公司，PCR mixture、ddH2O購自北京康為世紀生物技術有限公司。PCR儀，Biometra公司；HPG400型光照培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；電穿孔儀，美國Bio-Rad公司。

1.1.3 培養基及電擊緩沖液 鹽藻液體培養基配方如下[1]：1.5 mol/L NaCl，12 mmol/L KNO3，0.4 mmol/L KH2PO4，5 mmol/L MgSO4，185 μmol/L H3BO3，0.2 mmol/L CaCl2，2 μmol/L FeCl3，7 μmol/L MnCl2，1 μmol/L ZnCl2，1 μmol/L CoCl2，1 μmol/L CuCl2，1 μmol/L(NH4)6Mo7O24，5 μmol/L Na2EDTA。0.11 MPa滅菌20 min，冷卻后用過濾除菌的1 mol/L NaHCO3調pH值至8.0。鹽藻固體平板培養基為液體培養基中加入10 g/L瓊脂。

2×HEPES電擊緩沖液(100 mL)[2]：0.04 mol/L HEPES 0.953 2 g，1 mol/L NaCl 5.844 g，0.01 mol/L KCl 0.074 55 g，0.01 mol/L CaCl20.110 99 g，0.4 mol/L山梨醇 7.28 g，0.4 mol/L甘露醇 7.28 g，甘油 3.65 mL。用NaOH調pH值為7.2，過濾除菌，放4 ℃冰箱備用。

1.1.4 接頭和引物 引物用Primer Premier 5.0輔助設計，接頭引物及PCR引物的合成和測序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2pUC-chlN1622-CAT的構建鹽藻CCAP19/18以(5～6)×105mL-1的密度接種于新鮮鹽藻液體培養基內，明暗周期12 h12 h，26 ℃ 4 500 Lux光照培養7 d后，將500 mL的藻液采用優化的SDS-蛋白酶K-酚/氯仿/異戊醇方案抽提得到葉綠體DNA[3]。

以葉綠體DNA作為模板，采用引物1和2擴增chlN基因3’端編碼區及其下游非編碼區序列。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃充分延伸7 min，4 ℃停止反應。擴增獲得DNA片段chlN 1-1622，凝膠電泳檢驗并回收。

以chlN 1-1622為模板，采用引物3和4擴增得到片段chlN 1-809，采用引物5和6擴增得到片段chlN 815-1622。采用酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ對質粒pUC18與chlN 1-809進行雙酶切。雙酶切體系：chlN 1-809或質粒pUC18 4 μL；EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ各1.5 μL；10×buffer；用ddH2O補足50 μL。37 ℃水浴3 h，分別加入5 μL 10×Loading buffer終止反應。電泳回收后進行連接。反應體系：pUC18(EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切回收)片段1.5 μL；chlN 1-809 (EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切回收)片段3 μL；T4連接酶1 μL；用ddH2O補足10 μL。16 ℃水浴，連接12 h以上。轉化大腸桿菌感受態細胞，回收得到載體質粒pUC-chlN 809。

用SalⅠ和Hind Ⅲ雙酶切質粒pUC-chlN 809和片段chlN 815-1622，電泳回收，將回收后2個片段過夜連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，回收得到載體質粒pUC-chlN 809-808。

接頭的制備：采用無菌蒸餾水配制濃度為50 μmol/L的接頭引物1及2，各取5 μL加入90 μL無菌蒸餾水中混勻，95 ℃水浴5 min，取出后靜置，自然冷卻至室溫，引物退火形成接頭，接頭依次為BamH Ⅰ-EcoR V-SacⅠ-SmaⅠ-KpnⅠ-SalⅠ黏端。

用EcoRⅤ和SacⅠ雙酶切質粒pUC-chlN 809-808和接頭片段，電泳回收后過夜連接轉化大腸桿菌感受態細胞，回收得到載體質粒pUC-chlN 1622。EcoR Ⅴ和SacⅠ雙酶切pSP71-aptA-CAT載體，將目的片段CAT基因表達盒回收，載體pUC 1-1622用EcoRⅤ和SacⅠ雙酶切，回收pUC-chlN 1622片段，將目的片段CAT基因與回收的pUC-chlN 1622片段連接，最后得到載體pUC-chlN 1622-CAT。

1.3鹽藻的電擊轉化鹽藻按1.2培養7 d后，取1 mL鹽藻培養液，室溫 2 000 r/min離心5 min收集細胞，用新鮮培養基清洗1次，加入2×HEPES電擊緩沖液重懸細胞使其密度達到(1.0～1.1)×106mL-1，取400 μL混合液加入預冷的電擊杯內，加入終濃度為10 mg/L的目的質粒，混勻后冰浴 10 min；設定電擊參數25 μF、0.8 kV；電擊后冰浴5 min，最后 4 000 r/min離心5 min收集細胞，1 mL新鮮培養基重懸并在暗處靜置24 h恢復培養。如上對3管進行同樣操作，并對另外3管對照組進行相同的電擊轉化(不加質粒DNA)。對轉化后的每管轉化藻液先加氯霉素至100 mg/L，3 000 Lux光照進行過渡培養，1～2 d后加氯霉素至終濃度為300 mg/L，4 500 Lux光照進行20 d篩選培養，觀察鹽藻生長情況。

2 結果

2.1葉綠體轉化載體pUC-chlN1622-CAT的鑒定載體pUC-chlN 1622含chlN基因5’端區域及其上游序列，長809 bp，含chlN基因3’端編碼區808 bp，加上接頭30 bp，共長1 647 bp。酶切鑒定結果見圖1。

圖1 pUC-chlN 1622-CAT酶切結果

M：Marker；1：pSP71-atpA-CAT單酶切；2：pSP71-atpA-CAT雙酶切；3：pUC-chlN 1622-CAT單酶切；4：pUC-chlN 1622-CAT雙酶切；5：pUC-chlN 1622單酶切。

2.2鹽藻葉綠體的轉化和初步篩選野生藻與轉化藻電擊后的生長情況見圖2。在氯霉素濃度補至300 mg/L以后，野生藻與轉化藻在電擊后的前10 d左右，生長均受到抑制，細胞數量逐漸減少。但在10 d后野生藻逐漸白化并全部死亡，而轉化藻則繼續生長，表現出氯霉素抗性。

2.3轉化藻葉綠體基因中CAT基因的PCR鑒定PCR結果表明順利擴增出長約1 800 bp的CAT基因，見圖3。

圖2 野生藻與轉化藻電擊后的生長情況

圖3 CAT基因的PCR鑒定結果

3 討論

近年來葉綠體轉化系統逐步發展完善，葉綠體系統對蛋白質的加工修飾除不能糖基化，其他修飾均能在葉綠體系統正常進行，并且葉綠體系統還具有能夠正確折疊和組裝復雜蛋白的功能，使其產生活性。這一特點無疑讓葉綠體系統在與原核系統相比更似真核系統。利用藻類葉綠體表達系統作為新型生物反應器生產活性蛋白具有良好的前景[4]。因葉綠體表達系統插入位點可控，基因沉默、基因失活等現象較少發生，人們開始大量嘗試在高等植物體和藻類的葉綠體中轉化表達外源性基因。其插入位點雖人為可控，但也只是局限于部分可操作區域，導致了葉綠體系統的轉化重組率較核基因組低。因此，在設計構建同源載體時，同源片段的選擇尤為重要。

選擇同源片段應考慮以下幾個因素：①藻類葉綠體基因已知，這對同源片段的獲得和確定起決定性作用。②同源臂長度適當。同源片段過短同源重組發生率低，片段過長則操作復雜，轉入難度加大。李軼女等[5]曾在高等植物的轉化中采用的同源臂兩端的長度在1 000～2 000 bp，結果證明了這樣的長度對轉化起著較好的作用，而在衣藻中500 bp也能成功轉錄。③同源片段兩端的內切酶盡量不同，且具有單一性，目的是方便在進行該片段的克隆時，酶切后均能保持該目的片段的完整性?？赏ㄟ^序列查找或PCR法引入單一的限制性酶切位點。④插入同源片段中間的位點應合適，保證外源基因插入并隨之整合到葉綠體基因組后，不會影響葉綠體及宿主本身的生存活動，這是最基本的要求。⑤選擇克隆的片段與原葉綠體基因組應具有較好的同源性，這樣不僅能使外源目的基因整合入宿主葉綠體基因相對較容易，而且在發生整合以后，除重組段外葉綠體其他基因組序列不會發生變化。

作者以已經獲得全長269 044 bp的葉綠體基因組全序列[6](GenBank號：GQ250046.1)的杜氏鹽藻CCAP19/18[7-10]為研究藻種，克服了絕大多數物質因葉綠體序列資料缺乏而使轉化難以實施的情況。選取chlN基因作為同源片段，將外源基因插入其內。chlN基因與chlB、chlL一起編碼光非依賴的原葉綠素酸酯還原酶，任一破壞均可阻斷葉綠素在黑暗條件的合成，但藻類可通過光依賴的原葉綠素酸酯還原酶合成葉綠素，不影響其生存。在同源片段長度的選擇上，作者采用兩端同源片段均800 bp以上，足夠其實現同源重組及轉化。葉綠體基因組的同質化程度同樣也是制約轉化的主要原因。所謂同質化就是在外源基因轉入后，葉綠體自身的基因組中與同源載體同源的片段不斷地被載體中的同源片段所替代，而轉化子的抗性也隨之不斷提高。若采用的選擇壓力既能夠讓同質化過程順利進行，又能在轉化藻抗性顯現時將未轉化的藻株全部殺死，那么就能順利地選擇分離得到所需的含目的基因的藻株。作者選擇氯霉素用于篩選，其篩選周期在10 d左右，給同質化過程提供了時間，并在10 d后可逐漸觀察到未轉化的藻株漸漸白化并死亡。

作者以鹽藻葉綠體作為生物反應器，構建轉化篩選載體pUC-chlN 1622-CAT，電擊法轉入鹽藻細胞，在氯霉素抗性選擇壓力下，對轉化的鹽藻細胞進行篩選，并檢測CAT基因的表達情況，確定了以chlN基因為同源片段構建鹽藻葉綠體轉化載體的初步可行性。該研究為在鹽藻葉綠體內高效表達外源性蛋白提供了先決條件。

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