與杜氏鹽藻驅動蛋白Ⅱ動力亞基C端相互作用的新蛋白的酵母雙雜交篩選*

李 靚，崔柳青，王瑞莉，毛麗紅，韓 康，柴丹丹，薛樂勛#

1)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室 鄭州 450001 2)河南工業大學生物工程學院 鄭州 450001

驅動蛋白作為細胞內一類馬達蛋白，在細胞內物質運輸中扮演著重要角色。其成員驅動蛋白Ⅱ是參與鞭毛內運輸的關鍵動力蛋白之一，包括含馬達結構域的FLA8、FLA10兩個動力亞基及一個非動力亞基KAP，其中FLA8與FLA10兩個亞基的C端相互纏繞，形成螺旋-卷曲-螺旋結構[1]。有研究[2-3]表明鞭毛內運輸機制不僅對于纖毛的組裝是必要的，而且在組織纖毛產生的信號通路中也發揮重要作用。杜氏鹽藻是一種單細胞綠藻，培養條件簡單。由于其具有一對等長的鞭毛而常被用作研究鞭毛內運輸及鞭毛相關疾病的模式生物。為了篩選參與鞭毛內運輸及相關信號通路的蛋白，作者以FLA8 C 端為誘餌，采用酵母雙雜交的方法從杜氏鹽藻的cDNA酵母文庫中篩選與之相互作用的新蛋白。

1 材料與方法

1.1實驗材料及試劑杜氏鹽藻購自美國德州大學，杜氏鹽藻cDNA酵母文庫為鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室構建，EcoRⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ 等DNA限制性內切酶、pMD19-T載體、DNA連接試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，酵母雙雜交所用載體pGBKT7、菌株Y187和AH109均購自Clontech公司，酵母蛋白提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，篩選試劑X-α-Gal、3-AT購自Sigma公司。

1.2FLA8cDNA片段的擴增提取杜氏鹽藻總RNA，反轉錄成cDNA作為模板，設計兩端分別帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的FLA8 C端特異性引物(EcoRⅠ-FLA8：5’-CCGGAATTCGTGGGCAT CAGCGAGGACCA-3’，BamHⅠ-FLA8：5’-CGCGGATC CTCATGCAGGCTTAGAAGACG-3’)，以制備好的cDNA為模板，PCR擴增FLA8 C端的cDNA片段。

1.3pGBKT7-FLA8-C誘餌表達載體的構建將得到的FLA8 C端PCR產物和載體pGBKT7用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，分別回收大小為1 302 bp和7 300 bp的目的片段，并按照DNA連接試劑盒連接，轉化大腸桿菌DH5α，藍白斑篩選得到陽性菌落，擴大培養，提取質粒pGBKT7-FLA8-C備用。

1.4自激活檢測按照Clontech小規模酵母轉化說明書將構建好的pGBKT7-FLA8-C誘餌表達載體轉化入酵母菌株Y187和AH109中，同時以pGBKT7-53和空載體分別作為陽性和陰性對照。得到的克隆分別劃線于SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-His/-Trp/X-α-Gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal固體培養基上。如果在SD/-His/-Trp/X-α-Gal培養基上生長，在雜交篩選中需加入組氨酸抑制劑3-AT以抑制His泄露。如果在SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養基上生長，則誘餌蛋白對報告基因有自激活作用，不適合用酵母雙雜交篩選相互作用蛋白。

1.5毒性檢測將含有誘餌表達載體和空載體的Y187和AH109菌株分別劃線于SD/-Trp固體培養基上倒置培養，挑取大小相同的克隆分別接種于SD/-Trp液體培養基中，30 ℃、250 r/min，過夜振蕩培養，測光密度值。若含誘餌表達載體的菌株光密度值明顯低于含空載體的菌株，則說明誘餌蛋白的存在阻礙了酵母菌株的生長，該蛋白不適合用酵母雙雜交篩選相互作用蛋白。

1.6誘餌蛋白表達情況檢測按照酵母蛋白提取試劑盒提取酵母蛋白，SDS凝膠電泳，以Myc 小鼠單抗為一抗，HRP標記的兔抗小鼠IgG為二抗，Western blot檢測。

1.7酵母雙雜交取1 mL文庫菌在冰上融化后與預先活化的Y187(含pGBKT7-FLA8-C質粒)菌株共同轉接于5 mL 2×YPDA/kanr的液體培養基中，30 ℃緩慢搖晃，20 h后取樣觀察是否有三葉形合子形成，若無或者量較少，則繼續培養至24 h。

1.8雜交結果篩選雜交后的菌液涂于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養基上，30 ℃倒置培養3～5 d至克隆出現。挑取單克隆劃線于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/3-AT固體培養基上，30 ℃倒置培養3～5 d，若所挑取的克隆生長并表現為藍色，則按照同樣方法再轉接一代；若不再生長或者只生長而不變藍色則是假陽性。傳至第五代仍生長良好且表現為藍色的克隆即為陽性克隆。

1.9篩選結果鑒定挑取陽性菌落細胞作為模板進行菌落PCR，擴增得到的片段，膠回收后與pMD19-T載體連接，轉化DH5α，酶切鑒定，并將菌液送華大基因科技有限公司測序。

2 結果

2.1誘餌表達載體雙酶切鑒定用EcoRⅠ和BamHⅠ對pGBKT7-FLA8-C質粒雙酶切鑒定，電泳后表現出2條條帶，一條約7 300 bp，為線性的pGBKT7載體；另一條約1 300 bp，為插入的FLA8 C端cDNA片段(圖1)，該結果表明誘餌表達載體構建成功。經測序證明其中沒有發生突變，可用于酵母雙雜交實驗。

圖1 誘餌表達載體酶切鑒定

M：DL 10 kb相對分子質量標準；1：pGBKT7-FLA8-C質粒；2：pGBKT7-FLA8-CEcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切。

2.2自激活檢測將含有誘餌表達載體的酵母菌株AH109和Y187在SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-His/-Trp/X-α-Gal培養基上生長并變藍，而在SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養基上不能生長。提示酵母細胞存在本底His泄漏，加入3-AT至終濃度為15 mmol/L時，可以完全抑制His泄漏。

2.3毒性檢測含誘餌表達載體和pGBKT7空載體的Y187菌株接種過夜培養后測得其光密度值分別為1.25和1.34，表明誘餌蛋白的存在對酵母菌株無毒性。

2.4雙雜交配子形成檢測雜交20 h時取樣用顯微鏡觀察，圖2為×1 000時的酵母細胞，已經形成大量的三葉形合子，可進行下一步的篩選。

圖2 雙雜交配子形成檢測(×1 000)

2.5雙雜交結果見圖3。雜交的菌液在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/3-AT固體培養基上轉接5代后，有2個菌落仍表現為藍色，為篩選得到的陽性克隆。

圖3 酵母雙雜交篩選結果

1：陽性對照，Y187(含pGBKT7-53質粒)與AH109(含pGADT7-Rec-質粒)菌株雜交；2：陰性對照，Y187(含pGBKT7-Lam質粒)與AH109(含pGADT7-Rec-LargeT質粒)菌株雜交；3、4：Y187(含pGBKT7-FLA8-C質粒)與AH109(文庫菌)雜交篩選得到的陽性克隆。

2.6菌落PCR結果對雙雜交篩選得到的陽性克隆進行菌落PCR，得到大小分別為1 500和1 200 bp的片段。見圖4。

2.7雙雜交測序結果及序列分析結果陽性克隆中所含的cDNA片段及所表達的蛋白經測序鑒定，分別與衣藻、團藻、小球藻等生物的預測蛋白(含蛋白質結合結構域)和鞭毛相關蛋白107(FAP 107)同源。杜氏鹽藻預測蛋白部分氨基酸序列與衣藻和團藻相應序列的相似度分別為79%和80%，杜氏鹽藻鞭毛相關蛋白部分氨基酸序列與衣藻和團藻相應序列的相似度均為58%。

圖4 陽性克隆菌落PCR結果

3 討論

在細胞內，大分子蛋白質及復合物需要借助馬達蛋白將其運輸到目的區域。驅動蛋白是一類馬達蛋白，利用水解ATP釋放的能量沿著微管移動來運輸貨物蛋白[4]。驅動蛋白家族成員參與大分子、細胞器、囊泡的運輸，同時對有絲分裂、形態發育等細胞活動都有重要影響[5-6]。鞭毛/纖毛是細胞表面突起的亞細胞結構，纖毛異常會導致多囊腎疾病、肥胖癥、糖尿病及癌癥等人類疾病[7]。驅動蛋白Ⅱ是驅動蛋白家族的一個重要成員，在鞭毛內運輸中發揮著重要的作用[8]。鞭毛內運輸是一個動態平衡的過程，受到細胞內外各種因素的影響[9]，參與鞭毛/纖毛信號通路的調節，與多種疾病的發生相關[10]。

酵母雙雜交是一個能夠快速、直接分析體內蛋白之間相互作用的方法，可以在一定程度上反映細胞內的真實情況。用該方法篩選與驅動蛋白Ⅱ動力亞單位C端相互作用的蛋白，有助于了解鞭毛內運輸機制及其參與的信號通路[11]。該實驗中雙雜交篩選得到兩個和FLA8相互作用的蛋白：FAP107和一個預測蛋白。FAP107是由Pazour等[12]在萊茵衣藻的鞭毛蛋白質組學研究中發現的存在于鞭毛中的未知功能的蛋白質，其與FLA8尾部的結合提示該蛋白可能參與了驅動蛋白Ⅱ活性調控及相關信號的傳遞。篩選到的預測蛋白所含有的蛋白質結合結構域能夠與多種蛋白質的C末端相結合而參與信號傳遞[13]，因而該預測蛋白與FLA8 C端的結合很有可能與相關信號的傳遞有關。

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