N-乙酰半胱氨酸對博萊霉素致小鼠肺間質(zhì)纖維化形成及NF-κB、IL-4表達(dá)的影響*

劉衛(wèi)青，張曉曄，朱 敏，秦秉玉

1)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450003 2)中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 沈陽 110004 3)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院呼吸科 鄭州 450003

近年來，隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和工業(yè)化的快速發(fā)展，肺間質(zhì)纖維化患者越來越多，但是該病的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床療效也差。已有研究[1-2]表明，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活化，調(diào)節(jié)許多致纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。作者以前的研究[3]顯示，在博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化病理過程中，肺組織NF-κB的表達(dá)明顯增強(qiáng)。另有研究[4]顯示，白介素-4(interleukin-4，IL-4)可增加肺成纖維細(xì)胞膠原的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，在肺纖維化病理過程中具有重要作用。作者觀察了抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)對小鼠肺間質(zhì)纖維化的治療作用，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料8周齡雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量17～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，寄養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實驗動物中心。BLM-A5(8 mg/支，天津太河制藥有限公司，批號：050101)，NAC(0.1 g/包，富露施，海南贊邦制藥有限公司，批號：060110)，NF-κB p65免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，IL-4酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司，羥脯氨酸(HYP)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。紫外光、可見光連續(xù)分光光度計(法國S500-P)，全自動酶標(biāo)儀(奧地利TECAN)，超聲勻漿機(jī)(德國UPH-200)。

1.2實驗動物分組及處理75只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組。BLM組25只，氣管注射BLM 5 mg/kg制作肺間質(zhì)纖維化模型[5]；NAC組25只，于注射BLM前5天開始每天給予NAC 250 mg/kg直至取材；對照組25只，氣管注射生理鹽水20 μL。3組小鼠于實驗第1、3、7、14、28天以腹腔主動脈放血法處死(每組每個時間點(diǎn)5只)后，行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)灌洗3次，將收集的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)3 000 r/min離心10 min，取上清液-70 ℃凍存待測IL-4。所得細(xì)胞進(jìn)行離心涂片，冷丙酮固定后用于測NF-κB的表達(dá)。

1.3肺組織病理學(xué)觀察左肺灌注40 g/L多聚甲醛直至肺表面光滑，結(jié)扎氣管后取出左肺，放入40 g/L多聚甲醛中固定3 h，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚切片，行HE染色和Masson染色。

1.4肺組織HYP含量的測定按試劑盒說明書操作(樣本堿水解法)。

1.5支氣管肺泡灌洗細(xì)胞NF-κBp65的檢測將固定后的支氣管肺泡灌洗細(xì)胞進(jìn)行p65(NF-κB的功能亞單位)SP免疫組化染色。一抗為小鼠p65單克隆IgG抗體，以PBS代替一抗作為陰性對照，按免疫組化試劑盒步驟操作，DAB顯色，以細(xì)胞核染成棕黃色為陽性，每張玻片隨機(jī)選取5個視野(×400)，計算視野內(nèi)陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例。

1.6BALF中IL-4含量測定ELISA法檢測IL-4的含量，按試劑盒說明書操作，使用全自動酶標(biāo)儀測492 nm處吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-4的含量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較同一時間點(diǎn)不同組別HYP、NF-κB陽性細(xì)胞百分比和IL-4含量的差異，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠肺組織病理結(jié)果HE及Masson染色結(jié)果見圖1。

圖1 3組小鼠肺組織HE染色和Masson染色(×400)

結(jié)果顯示，BLM組小鼠經(jīng)氣管注射BLM后第7天，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)可見滲出改變，內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤；第14天肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，可見多發(fā)片狀實變(Masson染色可見肺間質(zhì)內(nèi)有明顯的膠原沉積)；第28天肺組織可見大片的實變，其間可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)明顯喪失(Masson染色可見肺間質(zhì)大量的膠原沉積，纖維化改變明顯)。與BLM組小鼠相比，NAC組小鼠第14天肺泡炎癥明顯減輕，肺泡間隔略有增厚，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕；第28天可見肺實變程度較BLM組明顯減輕，可見破壞的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間隔明顯增厚，間質(zhì)內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，有明顯膠原沉積。

2.2 3組小鼠肺組織HYP含量的比較見表1。

2.3 3組小鼠支氣管肺泡灌洗細(xì)胞NF-κB的表達(dá)見圖2、表2。

2.4 3組小鼠BALF中IL-4含量比較見表3。

表1 3組小鼠肺組織HYP含量的比較 (n=5) μg/g

#與對照組比較，P<0.05；*與NAC組比較，P<0.05。

圖2 第7 d 3組小鼠支氣管肺泡灌洗細(xì)胞NF-κB的表達(dá)(SP，×400)

表2 3組小鼠支氣管肺泡灌洗細(xì)胞中NF-κB陽性細(xì)胞百分比的比較 (n=5) %

#與對照組比較，P<0.05；*與NAC組比較，P<0.05。

表3 3組小鼠BALF中IL-4含量的比較 (n=5) ng/L

#與對照組比較，P<0.05；*與NAC組比較，P<0.05。

3 討論

目前認(rèn)為，在肺間質(zhì)纖維化病理過程中存在氧化/抗氧化失衡和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡[1-2,6]。抗氧化劑NAC口服后可脫去乙酰基變?yōu)榘腚装彼峒垂入赘孰牡那绑w[7]，提高還原巰基水平，發(fā)揮抗氧化作用，糾正氧化失衡。但NAC對細(xì)胞因子的作用機(jī)制仍不清楚，故對這一問題的研究有助于進(jìn)一步闡明NAC及NF-κB在肺間質(zhì)纖維化中的作用。

有研究[3，8]顯示，NF-κB是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)許多炎癥性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。活化的NF-κB是由兩個蛋白亞單位構(gòu)成的二聚體，p65是其重要的功能亞單位。在BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化病理過程中，存在著Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡失調(diào)，當(dāng)Th1型細(xì)胞因子占優(yōu)勢時，可抑制肺間質(zhì)纖維化的形成[8]，當(dāng)Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢時，有利于肺間質(zhì)纖維化的形成。IL-4是重要的Th2型細(xì)胞因子，能促進(jìn)其他Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并抑制Th1型細(xì)胞因子的生成，使Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向Th2型優(yōu)勢發(fā)展。同時IL-4可刺激肺成纖維細(xì)胞，增加膠原的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積[4]。

該研究結(jié)果顯示，在BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化病理過程早期，NF-κB p65在支氣管肺泡灌洗細(xì)胞胞核的表達(dá)即明顯增強(qiáng)，同時IL-4在BALF中的表達(dá)也明顯增強(qiáng)，這與其他研究結(jié)果類似[9-10]，而且IL-4與NF-κB p65表達(dá)強(qiáng)度的時間變化相似，而NAC明顯抑制了BLM誘導(dǎo)的NF-κB活化和IL-4的產(chǎn)生。作者以往的研究[11]顯示，小鼠氣管注射BLM后1天，支氣管肺泡灌洗細(xì)胞表達(dá)的NF-κB p65和IL-4間存在著正相關(guān)關(guān)系。目前尚未見文獻(xiàn)報道NF-κB對IL-4的合成具有直接調(diào)控作用，但兩者之間卻聯(lián)系緊密[12]，如缺乏NF-κB p50亞基小鼠的Th2細(xì)胞不能產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13，抑制NF-κB的活性可以阻斷T細(xì)胞中GATA-3的表達(dá)和Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[13]。據(jù)此推測，肺泡內(nèi)單核巨噬細(xì)胞NF-κB的活化可能通過間接途徑使IL-4合成增強(qiáng)，并進(jìn)一步引發(fā)Th2型細(xì)胞因子的優(yōu)勢表達(dá)，使BLM誘導(dǎo)的肺損傷向形成纖維化的方向發(fā)展。NAC通過抗氧化作用減輕氧化損傷，抑制了活性氧刺激的NF-κB激活[14]，進(jìn)而可能通過NF-κB的間接途徑下調(diào)IL-4的表達(dá)，從而糾正細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，最終抑制了肺間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

此外，該研究還顯示，NAC不僅明顯減輕了BLM所致小鼠肺泡炎癥和肺組織纖維化程度，還抑制了肺組織HYP水平的增高。這進(jìn)一步說明NAC可抑制BLM誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化形成。

總之，抗氧化劑NAC可能通過抑制NF-κB的活化，減少IL-4等致纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕BLM致小鼠肺間質(zhì)纖維化。NF-κB的活化和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化病理過程中具有重要作用。

[1]Forman HJ,Torres M.Reactive oxygen species and cell signaling[J].Am J Respir Crit Care Med，2002，166(12 Pt 2)：s4

[2]Janssen-Heininger YM,Persinger RL,Korn SH，et al.Reactive nitrogen species and cell signaling[J].Am J Respir Crit Care Med，2002，166(12 Pt 2)：s9

[3]張曉曄，周妍，劉衛(wèi)青，等.核因子κB在博萊霉素致小鼠肺纖維化病理過程中的動態(tài)表達(dá)[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，36(5)：505

[4]Lukacs NW，Hogaboam C，Cheensue SW，et al.Type1/Type2 cytokine paradigm and the progression of pulmonary fibrosis[J].Chest，2001，120(1 Suppl)：5S

[5]陳祥銀，嚴(yán)儀昭，曾衛(wèi)東，等.丹參、川芎嗪及糖皮質(zhì)激素對肺纖維化保護(hù)作用的實驗觀察[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，1987，10(3)：152

[6]張曉曄，侯顯明.轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與非特異性炎癥[J].國外醫(yī)學(xué)：呼吸系統(tǒng)分冊，2000，20：41

[7]徐凌，蔡柏薔.N-乙酰半胱氨酸在肺部疾病中的應(yīng)用進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)：呼吸系統(tǒng)分冊，2004，24(6)：413

[8]Sime PJ，O’Reilly KM.Fibrosis of the lung and other tissues：new concepts in pathogenesis and treatment[J].Clin Immunol，2001，99(3)：308

[9]Castranova V，Porter D,Millecchia L,et al.Effect of inhaled crystalline silica in a rat model：time course of pulmonary reactions[J].Mol Cell Biochem，2002，234/235(1/2)：177

[10]Wallace WA，Howie SE.Immunoreactive interleukin 4 and interferon-gamma expression by type Ⅱ alveolar epithelial cells in interstitial lung disease[J].J Pathol，1999，187(4)：475

[11]張曉曄，周妍，劉衛(wèi)青，等.核因子κB反義寡核苷酸對博萊霉素致小鼠肺間質(zhì)纖維化形成及白細(xì)胞介素4表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87(3)：195

[12]Yu M，Qi X，Moreno JL，et al.NF-κB signaling participates in both RANKL- and IL-4-induced macrophage fusion：receptor cross-talk leads to alterations in NF-κB pathways[J].J Immunol，2011，187(4)：1797

[13]Das J，Chen CH，Yang L，et al.A critical role for NF-κB in CATA-3 expression and Th2 differentiation in allergic airway inflammation[J].Nat Immunol，2001，2(1)：45

[14]Mercurio F,Manning AM.NF-kappa B as a primary regulator of the stress response[J].Oncogene，1999，18(45)：6163