肝癌細胞中C60含量的熒光分析法測定*

姚寒春，孫 敏，張振中

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

C60又稱富勒烯，是碳的第三種同素異形體。C60是完全由碳組成的中空球體，呈橢圓形或管形，表面含有20個六邊形和12個五邊形，共有60個頂點，在物理及化學性質上可看作三維的芳香化合物[1-2]。C60在醫藥方面有許多重要的應用，極易吸附在肝癌細胞的表面并進入肝癌細胞內部[3]。隨著在生物醫藥領域中的廣泛應用，C60不可避免地會在生物體內累積，對生物體產生一定的毒害損傷[4-5]。因此，分析測定肝癌細胞中C60含量具有重要意義。有關C60含量測定的報道大多采用色譜方法應用于環境和材料領域[6]，關于生物樣品中的檢測報道很少[7]。Sene等[8]采用熒光分光光度法，基于C60顆粒的光散射性質，對水溶液中的C60顆粒進行定量，檢測限達到0.009 mg/L。作者基于C60自身的熒光性質和無需化學修飾的特點，采用熒光分光光度法測定了肝癌細胞中C60含量，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑①熒光分光光度計(日本島津RF-5301PC)，JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，LH50A型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，超低溫保存箱(日本SANYO公司)，LE-80K型超高速離心機(美國Beckman公司)。②C60(河南濮陽永新科技有限公司，純度99.9%)，泊洛沙姆F68(德國BASF公司)，含雙抗的RPMI 1640培養基及胰蛋白酶(美國Gibco公司)，肝癌細胞(鄭州大學藥學院)，胎牛血清(天津TBD公司)，體積分數75%醫用乙醇(分析純，天津四友化學試劑有限公司)，實驗用水為超純水。

1.2溶液制備

1.2.1 C60分散液的制備 精確稱取C60粉末適量至5 mL具塞離心管中，加入2 mL 的泊洛沙姆F68(10 g/L)溶液，渦旋5 min，60 ℃水浴超聲2 h后，連接于超聲波細胞粉碎儀上，調整工作時間為6 s，間隔時間為8 s，工作次數為10次，并調節工作壓力至400 W，進行超聲處理。最后，將溶液以5 000 r/min離心5 min取上清，得到C60分散液。

1.2.2 肝癌細胞裂解液的制備 肝癌細胞經過傳代，在細胞培養箱中培養24 h，然后在細胞培養瓶中貼壁，貼壁面積為70%～80%時用PBS沖洗干凈，以2.5 g/L胰酶消化5 min(37 ℃)，收集消化液以1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入5 mL PBS，用細胞計數板計數肝癌細胞，然后置于超聲細胞粉碎儀上，以400 W的工作壓力破碎細胞，4 000 r/min離心10 min取上清，得到肝癌細胞裂解液。

1.2.3 C60-肝癌細胞裂解液的制備 在肝癌細胞生長80%～90%左右加入961.58 mg/L 的C60分散液1.8 mL，作用24 h后，按1.2.2項處理肝癌細胞，得到C60-肝癌細胞裂解液。

1.3C60與肝癌細胞作用時間的考察肝癌細胞經傳代后生長至70%左右，加入C60分散液，置于CO2培養箱中培養，分別于培養0、12、24及48 h后于倒置顯微鏡下觀察肝癌細胞形態。

1.4C60熒光分光光度法測定實驗考察了220～900 nm波長范圍內不同質量濃度C60分散液的激發和發射光譜，見圖1。結果表明C60分散液的最佳激發波長為220 nm，最大發射波長為371 nm，因此選擇371 nm作為C60含量測定波長。

圖1 C60分散液的熒光圖譜

1.5方法學考察

1.5.1 線性關系 取C60分散液5、10、20、50、150及180 μL，用肝癌細胞裂解液(1×104mL-1)稀釋，配制成質量濃度分別為1.28、2.56、5.12、12.80、38.40及46.08 mg/L的標準液，以220 nm為激發波長，在371 nm發射波長處測定標準液熒光強度。以C60質量濃度C為橫坐標，熒光強度I為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程。

1.5.2 精密度實驗 將C60分散液用肝癌細胞裂解液稀釋，配制成2.56、25.57和46.08 mg/L的樣品溶液，用熒光分光光度法測定其熒光強度。每個樣品日內重復測定5次，連續測定3 d，考察其日內和日間精密度。

1.5.3 回收率實驗 在一定質量濃度的C60-肝癌細胞裂解液樣品中分別加入C60分散液50、90及110 μL，測定樣品的熒光強度，按照標準曲線計算出C60含量及回收率。

1.6樣品含量測定吸取0.25 mL C60-肝癌細胞裂解液樣品3份，用超純水稀釋至3 mL(肝癌細胞數 1×104mL-1)，每份樣品平行測定熒光強度3次，取平均值，按照標準曲線計算C60含量。

2 結果

2.1樣品溶液的熒光圖譜在所選實驗條件下，C60分散液、肝癌細胞裂解液以及C60-肝癌細胞裂解液的熒光圖譜見圖2。由圖2可知，肝癌細胞內源性物質對C60分散液的熒光測定無干擾。

2.2C60作用不同時間對肝癌細胞形態的影響肝癌細胞與C60分散液作用0、12、24及48 h后的細胞形態見圖3。可以看出，培養24 h后，肝癌細胞有70%存活，生長狀態較為良好；48 h時，由于沒有新鮮的培養基，肝癌細胞開始出現死亡，所以在制備C60-肝癌細胞裂解液時，選擇作用24 h的細胞。

圖2 樣品溶液的熒光圖譜

A：C60-肝癌細胞裂解液；B：C60分散液；C：肝癌細胞裂解液。

圖3 C60分散液作用0、12、24及48 h后肝癌細胞的形態

A～D：分別為C60作用0、12、24及48 h后肝癌細胞的形態；E：普通顯微鏡下C60作用24 h后肺癌細胞的形態；F：熒光顯微鏡下C60作用24 h后肝癌細胞的形態。

2.3方法學考察結果

2.3.1 線性關系及精密度 在所選實驗條件下得到的標準曲線為：I=2.240 3C+44.188(r=0.995 8，P<0.05)；C60質量濃度在1.28～46.08 mg/L范圍內線性關系良好。根據S/N為3計算，得到檢測限為0.275 mg/L。精密度實驗結果較為滿意，見表1。

表1 肝癌細胞中C60測定的精密度實驗結果(n=5)

2.3.2 回收率及樣品分析 回收率實驗結果見表2。由表2可知，該方法測定C60的平均回收率為86.5%，RSD為10.8%。按照標準曲線計算，3份C60-肝癌細胞裂解液樣品中C60的平均含量為9.27 mg/L。

表2 肝癌細胞裂解液中C60測定的回收率實驗結果

3 討論

該實驗與以往報道的方法不同的是使用表面活性劑泊洛沙姆將C60分散在水溶液中，而不是采用甲苯等有機溶劑[9-10]。泊洛沙姆對肝癌細胞影響較小，實驗能真實反映肝癌細胞正常狀態下的攝取量。該實驗通過四因素三水平正交實驗考察了泊洛沙姆溶液濃度、泊洛沙姆溶液與C60粉末碳超功率、離心轉數及時間的影響，結果表明，泊洛沙姆溶液濃度為10 g/L，碳超功率為400 W，以5 000 r/min 離心5 min為最佳實驗條件。

C60分散液發射光譜在371 nm，培養基以及胰酶會對其熒光產生干擾，而PBS對C60分散液的熒光測定沒有干擾，所以該實驗中通過加入PBS代替培養基，胰酶消化肝癌細胞，以4 000 r/min 離心的方法去除培養基、胰酶的干擾。肝癌細胞中的蛋白、氨基酸發光以及肝癌細胞聚沉均會對C60的熒光測定產生影響。實驗中將肝癌細胞進行破碎，離心取上清，減小了肝癌細胞胞內物質對C60測定的影響。

作者利用C60本身發射熒光的性質，建立了測定肝癌細胞中C60含量的熒光分析法。方法學考察結果表明，該方法簡單、快速、準確度高，為今后生物樣品中C60的檢測提供了一個新的選擇。

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