應用抑制性消減雜交篩選志賀菌基因轉移耐多藥相關基因*

宋春花，王穎芳，段廣才#，郗園林

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州450001 2)河南科技大學醫學院預防醫學教研室 洛陽 471003

近年來，隨著抗生素的廣泛應用甚至濫用，志賀菌菌株頻繁發生變異，產生耐藥株，且耐藥率高、耐藥產生速度快及范圍廣[1-2]，給細菌性痢疾的防治帶來新的挑戰，因此深入探討志賀菌耐多藥機制成為目前解決志賀菌耐多藥的先決條件。該實驗采用差異表達基因克隆技術抑制性消減雜交[3]，以志賀菌敏感株構建的基因轉移耐多藥株基因組DNA為檢測子，敏感株基因組DNA為驅趕子，進行抑制性消減雜交，通過對志賀菌敏感株與基因轉移耐多藥株基因組進行完整對比，構建高效的基因轉移耐多藥志賀菌DNA消減雜交文庫，采用斑點雜交篩選基因轉移耐多藥相關基因，為探討志賀菌耐多藥機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1菌株、主要試劑及儀器敏感株：采用改良K-B紙片法，從臨床分離鑒定的志賀菌株中，篩選1株對頭孢噻吩、諾氟沙星、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑均敏感的福氏志賀菌株；基因轉移耐多藥株(轉移株)：為作者所在的課題組構建，見文獻[4]。AxyPrep細菌基因組DNA小提試劑盒(AXYGEN 公司)，PCR-Select Bacterial Genome Subtraction Kit(CLONTECH公司)，地高辛標記試劑盒(ROCHE公司)。Hybond-N+尼龍膜(Amersham 公司)，DNA擴增儀為 GeneAmp(r)PCR System 9700(美國ABI公司)。

1.2抑制性消減雜交文庫的構建①采用細菌基因組DNA小提試劑盒提取志賀菌敏感株、轉移株的全基因組DNA，以志賀菌敏感株基因組DNA為驅趕子，轉移株基因組DNA為檢測子，檢測子和驅趕子的DNA分別用同一種識別4堿基序列的限制性內切酶RsaⅠ酶切獲得平均長度約600 bp的DNA片段。②將檢測子DNA均分為2份，分別接上接頭Adaptor 1和Adaptor 2R。接頭外側序列與第1次PCR引物序列相同，而內側序列則與第2次巢式PCR引物序列相同，有利于后續PCR的篩選擴增。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定連接效率在25%以上。③兩輪消減雜交：用過量驅趕子DNA樣品分別與上述2份連有接頭的檢測子DNA樣品進行第1次消減雜交。然后，混合上述2份雜交樣品，同時加入新的變性驅趕子DNA進行第2次消減雜交。④兩次PCR反應：加入根據接頭設計的引物進行兩次PCR。⑤消減效率的檢測：以經消減雜交和未經消減雜交的第2輪PCR產物為模板，應用23S rRNA 5’和3’引物進行PCR擴增，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定兩次PCR產物及消減效率。⑥將基因轉移耐多藥抑制性消減雜交產物與pMD18-T 載體連接并轉化DH5α高效感受態細胞，克隆增殖，藍白斑篩選陽性克隆，計算轉化率，并將全部陽性克隆以體積分數30%的甘油保存，構建抑制性消減雜交文庫。

1.3志賀菌轉移耐多藥相關基因的篩選采用PCR技術鑒定消減雜交文庫中的部分陽性克隆，用地高辛標記試劑盒中DIG-High Prime將待標記的DNA探針片段變性后與隨機引物一起雜交，然后以此雜交的寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶Ⅰ大片段的催化下，合成與探針DNA互補的DNA鏈，反應液中含有DIG-11-dUTP，即形成地高辛標記的DNA探針；分別用RsaⅠ消化的志賀菌敏感株、轉移株DNA片段標記的探針與基因轉移耐多藥消減雜交文庫中80個陽性克隆巢式PCR產物進行斑點雜交，篩選基因轉移耐多藥相關基因片段；對篩選到的耐多藥相關基因片段用M13雙向引物測序，各差異片段序列通過http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行同源性檢索，物種選擇細菌。

2 結果

2.1志賀菌轉移耐多藥相關基因消減文庫的鑒定結果志賀菌敏感株與轉移株抑制性消減雜交基因片段經與pMD18-T載體連接、轉化克隆后，共獲得1 080 個陽性克隆，隨機挑取了192個陽性克隆做菌液PCR鑒定，有181個克隆含有插入片段，轉化率94.3%。采用巢式PCR引物鑒定消減文庫中隨機挑取的陽性克隆的插入片段，結果所有片段長度均在1 000 bp左右(圖1)，與預期結果相符。

圖1 消減雜交文庫部分陽性克隆的PCR鑒定

2.2探針濃度測定結果隨機引物法標記RsaⅠ消化的志賀菌敏感株、轉移株基因組DNA片段，經地高辛核酸檢測程序，顯色結果與標準對照DNA的顏色對比，根據稀釋倍數推算出標記探針的濃度。志賀菌敏感株和轉移株基因組酶切片段探針的質量濃度約為780和500 mg/L。

2.3基因轉移耐多藥陽性克隆的篩選經過對斑點雜交信號的對比(圖2)，初步獲得5個差異基因片段(在凝膠成像系統中檢測雜交信號相差5倍)，其中4個基因片段表現為與轉移株DNA片段標記的探針雜交信號增強，其相對應的陽性克隆編號分別為T2A11、T2F8、T2G7、T1F11；另1個則與敏感株DNA片段標記的探針雜交信號增強，其相對應的陽性克隆編號為T2F5。

2.4基因轉移耐多藥差異片段序列檢索結果基因轉移耐多藥差異片段經克隆測序后，在BLAST上進行同源序列檢索，結果該5個差異片段有3個未檢索到同源序列，2個與已知基因有同源性，分別為80.0%和50.1%，見表1。

表1 基因轉移耐多藥相關基因片段序列檢索結果

圖2 基因轉移耐多藥消減雜交文庫的差異篩選(斑點雜交)

A：與標記的轉移株基因組DNA探針雜交結果；B：與標記的敏感株基因組DNA探針雜交結果。

3 討論

3.1基因轉移耐多藥志賀菌DNA抑制性消減雜交文庫的構建研究細菌基因組的差異，構建DNA消減文庫是最有效的方法[3]。近幾年，也有學者把它應用于耐藥相關基因的篩選。季明春等[5]應用抑制性消減雜交技術構建耐藥性淋球菌與標準參考菌株差異DNA消減文庫，證明5個片段均為未知新序列，可能為新的耐藥相關基因。朱寧希等[6]用抑制性消減雜交發現了11個白血病多藥耐藥相關基因，包括S3核糖體蛋白基因、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位2基因及My023基因等，其中多數基因與腫瘤多藥耐藥的關系尚未見報道，提示了白血病多藥耐藥的發生可能存在新的機制。

構建高質量的抑制性消減雜交文庫是耐多藥相關基因研究的關鍵一步，而消減效率是抑制性消減雜交文庫能否構建成功的關鍵。經兩次消減雜交及兩輪抑制性PCR后，檢測子與驅趕子中相同的片段絕大部分被消減掉，而那些差異基因片段應該被富集。該實驗的消減效率分析表明，消減后的轉移株DNA均在28個循環之后才看到23S rRNA產物，而未消減的轉移株DNA可在18個循環后就看到23S rRNA產物，說明消減效率較高。此外，該研究將志賀菌敏感株與轉移株抑制性消減雜交基因片段與高效的克隆PCR產物專用載體pMD18-T連接、轉化克隆后，有效轉化率為94.3%，說明所構建的消減文庫質量好，特異度高，篩選的意義較大。

3.2基因轉移耐多藥相關基因作者所獲基因轉移耐多藥差異片段經測序后，在BLAST上檢索同源序列，結果該5個差異片段有2個與已知基因有較好的同源性，分別為Tn3926轉座子部分的轉座酶基因和23S rRNA核糖體核糖核酸；3個未檢索到同源序列，為未知序列，可能為新的基因轉移耐多藥相關基因。

3.2.1Tn3926轉座酶基因Lett等[7]于1985年首次從小腸耶爾森菌中分離出一種編碼汞抗性基因的轉座子Tn3926，并發現其編碼的轉座酶調節Tn21的轉座；1989年Turner等[8]克隆了Tn3926全長序列，發現其序列與Tn21同源性為80.0%。Lai等[9]應用抑制性消減雜交比較肺炎克雷伯桿菌產毒株與不產毒株基因組的差異，通過斑點雜交發現19個片段與肺炎克雷伯桿菌產毒相關，其中有2個片段編碼Tn3926轉座酶基因，說明轉座子參與了肺炎克雷伯桿菌的產毒。該研究篩選出的基因轉移耐多藥相關基因片段T2F8與Tn3926轉座酶基因同源，而轉座子的轉座酶又誘導插入序列的轉座，提示轉座子介導的耐藥模式在志賀菌基因轉移耐多藥機制中存在，推測其在抗性基因的水平轉移中起一定作用。

3.2.2 23SrRNA核糖體核糖核酸細菌對大環內酯類抗菌藥物產生耐藥性的重要機制是該類抗菌藥物的作用靶位發生改變。最早報道大腸桿菌對紅霉素產生耐藥的原因是23S rRNA上第2 058位的腺嘌呤被甲基化，這種甲基化是由一種質粒介導的甲基化酶的產生所致，這種甲基化酶能夠使23S rRNA上的一個關鍵性的腺嘌呤殘基甲基化，從而可能引起核糖體構型變化，阻礙紅霉素與SOS核糖體亞基的結合，使進入胞內的抗生素不能與之結合而失去作用[10-11]。另外，對臨床分離得到的耐紅霉素肺炎支原體的研究也發現這種耐藥性的產生[12]。1997年Versalovic等[13-14]報道了克拉霉素耐藥性的產生與H.pylori23S rRNA基因的點突變有關，導致核糖體的構象改變，使大環內酯類抗生素結合位點也隨之發生改變，進而使H.pylori與大環內酯類藥物親和能力減弱，藥物不能阻止細菌的蛋白質合成，最終產生耐藥性。

該研究對差異片段T1F11測序并檢索發現其與23S rRNA基因同源性為50.1%，結合消減雜交中使用的檢測子為已構建的志賀菌基因轉移耐多藥菌株[4]，在構建過程中所使用的4類抗生素中并無大環內酯類藥物，說明23S rRNA所介導的細菌對大環內酯類抗菌藥物耐藥的機制在志賀菌基因轉移耐多藥機制中存在。

另外，研究中新發現了3個耐多藥相關基因片段，可能為耐多藥的新機制。雖然該研究僅對部分差異片段進行分析，但初步研究結果說明志賀菌耐多藥是多基因參與的復雜過程，后續研究將會發現更多的耐多藥相關基因，最終將全面闡明志賀菌的耐多藥機制。

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