先天性靜止性夜盲癥候選基因附近6個(gè)STR基因座在河南漢族人群中的遺傳多態(tài)性分析

楊 洋，朱運(yùn)良

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室 鄭州 450001

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)又稱為微衛(wèi)星DNA，是存在于人類基因組DNA中的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列，不同數(shù)目的核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列[1]。STR在不同種族和地域人群中有很大的差異。作為一種遺傳標(biāo)記，STR可以通過連鎖分析應(yīng)用到家系研究中，即利用STR位點(diǎn)在家系中進(jìn)行分型，來判斷遺傳標(biāo)記在家系中是否與疾病產(chǎn)生共分離。作者選取了先天性靜止性夜盲癥(congenital stationary night blindness,CSNB)候選致病基因RHO、PDE6B和GNAT1附近的6個(gè)STR基因座，針對河南漢族人群100名健康無關(guān)個(gè)體進(jìn)行了遺傳多態(tài)性研究，獲得群體遺傳學(xué)和法醫(yī)學(xué)參數(shù)，期望為家系研究、CSNB致病基因篩選和定位提供理論依據(jù)，為法醫(yī)學(xué)的個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定提供一定的參考[2]。

1 材料與方法

1.1樣本100例無血緣關(guān)系的河南漢族正常個(gè)體血樣由河南省人口與計(jì)劃生育科學(xué)研究院提供，4 ℃保存。

1.2微衛(wèi)星的查找及引物設(shè)計(jì)從GenBank下載RHO、PDE6B、GNAT1這3個(gè)基因的DNA序列，用Tandem Repeats Finder在線軟件(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)在上下游查找到6個(gè)STR基因座，重復(fù)單位為4核苷酸，6個(gè)STR基因座的基本參數(shù)見表1。6對引物序列均用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見表2，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 6個(gè)STR基因座的基本參數(shù)

表2 6個(gè)STR基因座的引物序列

1.3PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析PCR擴(kuò)增體系為20 μL，內(nèi)含DNA模板1 ng,上、下游引物各1.5 μL(5 μmol/L)，dNTP 0.4 μL(10 mmol/L)，Taq聚合酶1 μL(1 U/μL)，10×Buffer(含Mg+2)2 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。采用降落PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，每一循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃，共14個(gè)循環(huán)；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，20個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色。用阿拉伯?dāng)?shù)字1～7分別表示從小到大的等位基因。

1.4數(shù)據(jù)處理采用美國Promega公司提供的PowerStatsV12.xls對6個(gè)STR基因座進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出各基因座的等位基因及基因型頻率、雜合度(heterozygosity，H)、個(gè)體識(shí)別率(discrimination power，DP)、多態(tài)性信息含量(polymorphic information content，PIC)、非父排除率(excluding probability of paternity，PE)及匹配概率(match probability，MP)、父權(quán)指數(shù)(paternity index，PI)。對這6個(gè)基因座進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1河南漢族人群中6個(gè)STR基因座基因型的分布河南漢族人群中D3R1檢出5個(gè)等位基因14種基因型，D3R2檢出3個(gè)等位基因6種基因型，D4P1檢出5個(gè)等位基因12種基因型，D4P2檢出4個(gè)等位基因9種基因型，D3G1檢出4個(gè)等位基因10種基因型，D3G2檢出5個(gè)等位基因13種基因型。6個(gè)基因座在河南漢族人群中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。各等位基因頻率以及Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 6個(gè)STR基因座的等位基因頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.2河南漢族人群中6個(gè)STR基因座的多態(tài)性這6個(gè)STR基因座在河南漢族人群中的H、PIC、DP均較高，具體的遺傳學(xué)參數(shù)結(jié)果見表4。

表4 河南漢族人群中6個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性參數(shù)

3 討論

CSNB是一類主要損害視桿系統(tǒng)的家系遺傳性視網(wǎng)膜疾病，其臨床特點(diǎn)為患者出生后即出現(xiàn)夜盲，白天視力和視野一般正常，無眼底疾患且病況終生不變[3]。該病遺傳方式符合孟德爾遺傳規(guī)律，有常染色體顯性遺傳(autosomal dominant,AD)、常染色體隱性遺傳(autosomal recessive,AR)和X連鎖隱性遺傳3種方式(X-linked recessive,XL)，其中以AD遺傳方式最為常見。

STR在人類基因組中大量存在，一般認(rèn)為人類基因組DNA中平均每6～10 kb就有一個(gè)STR位點(diǎn)，其多態(tài)性成為法醫(yī)物證檢驗(yàn)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定的豐富來源[4]。不同人體基因組微衛(wèi)星DNA重復(fù)單位的數(shù)目是可變的，因此形成了極其復(fù)雜的等位基因片段長度多態(tài)性。近年來有關(guān)STR及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已有大量報(bào)道，但STR位點(diǎn)在人類基因組中分布極廣，還有大量的STR位點(diǎn)尚待進(jìn)一步開發(fā)研究，如何篩選出更多雜合度高、多態(tài)信息含量豐富的STR位點(diǎn)成為當(dāng)今法醫(yī)界研究的重點(diǎn)[5]。陳輝等[6]就利用位于常染色體上的24個(gè)STR位點(diǎn)對河南漢族人群做過相關(guān)報(bào)道。

作者選取的RHO、PDE6B、GNAT1這3個(gè)基因均是AD-CSNB的候選致病基因。作者在這3個(gè)基因上、下游區(qū)域選取6個(gè)STR基因座，通過對河南漢族100個(gè)健康無關(guān)個(gè)體進(jìn)行群體調(diào)查，得到群體遺傳學(xué)參數(shù)。其中D3R1、D3R2、D4P1、D4P2、D3G1、D3G2的PIC為0.550～0.730(≥0.5),DP為0.761～0.891(>0.7)[7]，說明這6個(gè)STR基因座是一組較好的遺傳標(biāo)記，適合于家系研究以及CSNB致病基因連鎖研究。

遺傳標(biāo)記的多態(tài)性及其應(yīng)用價(jià)值可用H、PIC和DP來衡量，Gill等[8]提出把DP≥0.9,H≥0.7,PIC≥0.7，PE>0.5作為高鑒別能力STR位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。該研究中D3R1、D3R2、D4P1、D4P2、D3G1和D3G2的H分別為0.800、0.660、0.700、0.760、0.710和0.760，可見僅有D3R2不符合此標(biāo)準(zhǔn)。一般認(rèn)為，H越高說明該遺傳標(biāo)記的雜合性越大,在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用價(jià)值就越大。這6個(gè)STR基因座的DP在0.7～0.9，在群體中的個(gè)體識(shí)別率偏低，可能是由于樣本量較少的緣故。這6個(gè)STR基因座中僅有D3R1、D4P2、D3G2 的PE>0.5，表明這3個(gè)基因座的非父排除率較高，比較適用子親子鑒定的研究。綜合各遺傳學(xué)參數(shù)，可知D3R1、D4P2和D3G2在法醫(yī)學(xué)方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但是考慮到D3R1、D3G2位于同一染色體上，兩者是否具有連鎖關(guān)系，還有待于進(jìn)一步的研究，因此還無法確定在法醫(yī)學(xué)鑒定中是否可以進(jìn)行多個(gè)基因座的聯(lián)合檢測。

致謝：感謝河南省人口與計(jì)劃生育科學(xué)研究院的王鳳羽和王艷麗老師給予的幫助和支持。

[1]Payseur BA,Place M,Weber JL.Linkage disequilibrium between STRPs and SNPs across the human genome[J].Am J Human Genet,2008，82(5):1039

[2]Krenke BE,Tereba A,Anderson SJ,et al.Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system[J].J Forensic Sci,2002,47(4):773

[3]Kocyla-Karczmarewicz B,Gralek M,Juszko J,et al.Congenital stationary night blindness[J].Klin Oczna,2004,106(3 Suppl):509

[4]孫莉,孟曉峰,陳輝,等.河南漢族6個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性研究[J].醫(yī)藥論壇雜志,2008,29(2):13

[5]張建勛,樂曉萍,楊洋,等.河南漢族人群6q24-25.1區(qū)域STR 基因座的遺傳多態(tài)性[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011,46(4):566

[6]陳輝,徐朝陽,李曉文,等.常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列基因座在河南漢族人群親子鑒定中的應(yīng)用[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,45(6):983

[7]Nei M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J].Genetics,1978,89(3):583

[8]Gill P,Urquhart E,Millican N,et al.A new method of STR interpretation using inferential logic-development of a criminal intelligence database[J].Int J legal Med,1996,109(1):14