還原型谷胱甘肽對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

張鐵栓，張國俊#，劉 穎

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

支氣管哮喘(哮喘)是危害人類健康的常見呼吸系統(tǒng)疾病，近年來其發(fā)病率不斷攀升[1-2]。當(dāng)前對(duì)該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，研究[3]表明氧化-抗氧化失衡是其發(fā)病機(jī)制之一，因此，推測(cè)通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑含量、減輕肺組織抗氧化損傷能達(dá)到治療哮喘的目的。谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)是典型的非蛋白硫醇類物質(zhì)，它在一系列的酶類和非酶類反應(yīng)中發(fā)揮作用，維持組織中的氧化還原平衡。而γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine，γ-GCS)是還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)合成的關(guān)鍵限速酶，它的數(shù)量、活性及底物的濃度決定GSH 合成的速率和量[4]。作者以此為出發(fā)點(diǎn)，通過建立豚鼠哮喘模型，測(cè)定肺組織中GSH、γ-GCS及下游炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，同時(shí)與常規(guī)抗炎激素進(jìn)行比較，觀察GSH對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康豚鼠48只，雌雄各24只，體質(zhì)量(450±25) g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑：雞卵白蛋白購自美國Sigma公司，GSH、γ-GCS和TNF-α檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。儀器：圖像采集(德國Lecia顯微照像系統(tǒng))、分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1.6)。注射用GSH(0.6 g/支)購自重慶藥友制藥有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、建模48只豚鼠實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組和GSH組4組，每組各12只動(dòng)物。參照文獻(xiàn)[5]的方法制備哮喘模型。模型組、地塞米松組和GSH組腹腔注射100 g/L雞卵白蛋白2 mL，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水2 mL；2周后，對(duì)照組霧化吸入生理鹽水，模型組、地塞米松組和GSH組霧化吸入10 g/L的雞卵白蛋白誘使哮喘發(fā)作。在誘發(fā)前，模型組腹腔注射生理鹽水2 mL，地塞米松組和GSH組分別按地塞米松2 mg/(kg·d)和GSH 0.1 g/(kg·d)劑量腹腔注射2 mL配比液，共7 d。

1.3支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查、肺組織學(xué)觀察及肺組織中GSH、γ-GCS和TNF-α的測(cè)定各組豚鼠末次激發(fā)結(jié)束后，用100 mg/kg戊巴比妥麻醉，打開胸腔，暴露心肺，分離出氣管，夾閉左主支氣管，對(duì)右肺灌洗3次，收集肺泡灌洗液離心，取上清液進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。取下右肺制作組織勻漿，離心后取上清液按試劑盒說明測(cè)GSH。取下左肺，部分以體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，做HE染色及特殊染色。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水、抗原修復(fù)及兔血清封閉，加相應(yīng)的γ-GCS和TNF-α抗體，生物素標(biāo)記兔IgG，經(jīng)SABC 孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后，脫水封片。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組大鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果和肺組織中GSH、γ-GCS及TNF-α表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果見表1。

表1 支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞分類 104 mL-1

*與模型組比較，P<0.05;△與對(duì)照組比較，P<0.05；#與地塞米松組比較，P<0.05。

2.2肺組織學(xué)觀察結(jié)果見圖1。對(duì)照組肺組織、肺泡、支氣管結(jié)構(gòu)正常，支氣管無炎性細(xì)胞浸潤。模型組管腔周圍有大量嗜酸細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜有上皮脫落現(xiàn)象，部分剝蝕，平滑肌斷裂，基底膜破壞，管腔內(nèi)黏液和細(xì)胞團(tuán)塊堆積。與之相比，GSH組支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤相對(duì)較輕，上皮細(xì)胞較完整，基底膜破壞相對(duì)較輕。

2.3肺組織中GSH、γ-GCS和TNF-α測(cè)定肺組織中γ-GCS和TNF-α在支氣管壁和支氣管旁均有著色，呈褐色，GSH組γ-GCS和TNF-α陽性區(qū)光密度面積低于模型組，見表2、圖2。

表2 肺組織中GSH、γ-GCS和TNF-α測(cè)定 (n=12)

*與模型組比較，P<0.05;△與對(duì)照組比較，P<0.05；#與地塞米松組比較，P<0.05。

圖1 肺組織光鏡下病理改變 (HE，×200)

圖2 肺組織中γ-GCS和TNF-α的表達(dá)(SP，×200)

3 討論

隨著研究的不斷進(jìn)展，已有足夠證據(jù)表明哮喘患者存在氧化-抗氧化失衡[6]，因此，維持氧化-抗氧化平衡可能成為治療哮喘的一個(gè)新的出發(fā)點(diǎn)[7]。該研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GSH治療的豚鼠肺部病變明顯減輕，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：第一，肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞的總數(shù)顯著降低；第二，光鏡下病理表現(xiàn)顯示肺組織、肺泡、支氣管結(jié)構(gòu)等的病理改變顯著減輕。原因可能如下：GSH 是含有巰基的非蛋白三肽，是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的抗氧化劑，參與關(guān)鍵性細(xì)胞功能和代謝，包括抗氧化應(yīng)激和調(diào)控細(xì)胞生長、增殖，是許多保護(hù)系統(tǒng)的關(guān)鍵所在，在解除病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)二巰鍵形成、滅活ROS、合成DNA前體、維持氣道上皮完整性和使上皮細(xì)胞免受煙霧及氧化劑介導(dǎo)的肺損傷中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步證實(shí)氣道上皮細(xì)胞的保護(hù)作用是否主要來自于GSH，研究中作者對(duì)其合成的主要限速酶——γ-GCS進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSH組豚鼠肺組織γ-GCS的表達(dá)較模型組降低，說明γ-GCS消耗和GSH的應(yīng)用是一致的，與國內(nèi)相關(guān)報(bào)道[8-9]一致。

同時(shí)，在研究中作者又對(duì)下游因子TNF-α進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示GSH組支氣管旁TNF-α表達(dá)較模型組明顯降低。TNF-α作為一種重要的前炎癥因子，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[10-12]。它可刺激氣道平滑肌，激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子、白介素-8和粒單集落刺激因子，增加黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)炎性細(xì)胞在氣道表面的黏附力，增加血栓素的血管收縮活性和肺毛細(xì)血管通透性，使肺血管壓力升高，滲出增多。還可以趨化活性嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，釋放更多的炎癥介質(zhì)，還可以通過核轉(zhuǎn)移因子AP-1促進(jìn)與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子受體的基因表達(dá)，導(dǎo)致更多炎癥因子的釋放，加重組織損傷。

總之，氧化-還原系統(tǒng)失衡是哮喘發(fā)病機(jī)制之一，應(yīng)用GSH治療，可以有效地保護(hù)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞，減輕肺組織損傷。該研究結(jié)果為GSH治療哮喘提供了依據(jù)，但是否能推至臨床，尚需進(jìn)一步的研究。

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