霉酚酸酯對糖尿病大鼠腎組織中IGF-1、MMP-2表達的影響

李 敏，王建生，劉東偉

鄭州大學第二附屬醫院腎內科 鄭州 450014

隨著許多發展中國家生活方式和飲食習慣的西化，糖尿病(diabetes mellitus,DM)及糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)的發病率日趨升高，DN正成為發展中國家慢性腎臟病的主要病因。DN早期表現為腎臟體積增大、腎小球肥大和高濾過，其主要組織學改變是腎小球系膜基質增生、系膜細胞增殖、腎小球毛細血管袢及腎小管基底膜增厚[1-2]。基礎研究[3-4]證實腎臟局部胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)積聚和基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)活性降低在腎小球系膜基質生成與降解失衡過程中起重要作用。霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是一種新型免疫抑制劑，已試驗性的應用于DN的臨床治療，但確切機制尚不明確。作者觀察了早期DM大鼠腎組織中IGF-1和MMP-2的表達情況，探討MMF對DM大鼠腎臟的保護作用及可能存在的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD雄性大鼠36只(由河南省實驗動物中心提供)，體質量200～220 g，實驗過程中飼養于獨立通氣籠具中(河南省中醫學院第二附屬醫院中心實驗室)，籠具內條件：溫度(22±1) ℃，相對濕度(55±5)%，晝夜明暗交替。適應性喂養1周后進入實驗。

1.2主要試劑與藥品鏈脲菌素(STZ，美國Sigma公司)，用前溶于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=4.5)中；MMF(杭州中美華東制藥有限公司)用前溶解于二甲基亞砜(美國Sigma公司)中，并用5 g/L羧甲基纖維素鈉(天津市恒興化學試劑制造有限公司)配至所需濃度；SP法試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；兔抗大鼠IGF-1、MMP-2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標記的山羊抗兔IgG(美國 Jackson公司)；PVDF轉印膜(美國Pall公司)；ECL化學發光試劑盒(美國Pierce公司)。

1.3動物模型的建立及分組采用隨機數字表法將實驗動物隨機分為對照組(n=12)和模型組(n=24)，大鼠過夜禁食大于17 h，自由飲水，血糖儀(美國強生公司)測空腹血糖后，模型組以STZ 55 mg/kg一次性腹腔注射，對照組按體質量給予相當量枸櫞酸緩沖液腹腔注射。48～72 h后測隨機血糖，≥16.7 mmol/L為大鼠DM模型誘導成功[5-6]。模型組中3只大鼠血糖未達標，剔除后，按隨機原則分為DM組(n=11)和MMF組(n=10)。每日8：00時MMF組給予MMF 15 mg/kg灌胃，對照組和DM組按體質量給予相當量溶媒灌胃。所有大鼠實驗期間(8周)自由進食、飲水，不應用胰島素。

1.4標本采集各組動物處死前置于代謝籠中，準確收集24 h尿液，測24 h尿蛋白、尿肌酐(全自動生化分析儀)。稱體質量后戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，測血糖(強生血糖儀)、血肌酐(全自動生化分析儀)，計算內生肌酐清除率(Ccr)。4 ℃生理鹽水反復灌洗腎臟后，游離左腎，稱質量，計算相對腎質量(左腎質量/體質量)。然后沿腎門縱向剖開，置于體積分數10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。游離右腎，冰上取腎皮質切成小塊，立即置于液氮中，再轉入-70 ℃冰箱待測腎組織IGF-1、MMP-2。

1.5腎組織病理學觀察石蠟切片(3 μm厚)，常規脫蠟后，PAS染色，高倍鏡下觀察腎組織形態學改變。

1.6腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的免疫組化檢測采用SP法。兔抗大鼠IGF-1、MMP-2多克隆抗體均按100倍稀釋。德國Lecia顯微照像系統采集圖像，Biosens Digital Imaging System v1.6軟件分析圖像，每張切片高倍鏡下測定20個視野，測定陽性區平均積分光密度值，取均值作為該切片的結果。

1.7腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的Westernblot檢測稱取100 g腎組織置于裂解液中冰上勻漿，超聲粉碎，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量。取蛋白60 μg煮沸5 min，經120 g/L SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜，麗春紅染色觀察轉膜效果，50 g/L脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，加入兔抗大鼠IGF-1、MMP-2多克隆抗體(均按 1 000 倍稀釋)，4 ℃過夜孵育，TBST搖床洗膜10 min×3次，辣根酶標記的山羊抗兔IgG(按4 000倍稀釋)雜交，室溫孵育2 h，TBST搖床洗膜10 min×3次，暗室中加ECL發光劑，曝光、顯影、定影，用圖像分析系統對雜交信號進行光密度掃描，用Quantity One圖像分析軟件分析目標條帶的光密度值。

1.8統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組大鼠生化指標、腎組織IGF-1、MMP-2蛋白表達的差異，應用Pearson積差相關系數分析24 h尿蛋白量與IGF-1、MMP-2蛋白表達量的相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠一般狀況及生化指標比較見表1。

2.2腎臟病理形態及免疫組化結果腎組織PAS染色顯示，與對照組比較DM組腎小球體積增大，系膜區基質明顯增生，腎小球毛細血管袢受壓，基底膜增厚，MMF組較DM組有所改善(圖1)。IGF-1、MMP-2免疫組化SP法染色示棕黃色或深棕黃色，在腎小球系膜區、基底膜及腎小管基底膜均有表達。IGF-1在DM組表達較對照組明顯增加，MMF組較DM組下降；MMP-2在DM組表達較對照組下降，MMF組較DM組增加。見表2、圖2。

表1 各組大鼠生化指標比較

*與對照組比較，P<0.05；#與DM組比較，P<0.05。

圖1 各組大鼠腎組織病理結果(PAS，×400)

組別nIGF-1 MMP-2 對照組12103.28±11.67 167.56±14.04 DM組11165.26±18.65?114.61±14.75?MMF組10136.46±12.47?#137.96±11.29?#F67.96258.442P<0.001<0.001

*與對照組比較，P<0.05；#與DM組比較，P<0.05。

2.3腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的表達見表3、圖3。

表3 各組大鼠腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的表達

*與對照組比較，P<0.05；#與DM組比較，P<0.05。

圖2 各組大鼠腎組織IGF-1、MMP-2表達(SP，×400)

圖3 各組大鼠腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的表達

2.4 24h尿蛋白量與IGF-1、MMP-2蛋白表達量的相關性24 h尿蛋白量與IGF-1相對表達量呈正相關(r=0.743，P<0.001)，而與MMP-2相對表達量呈負相關(r=-0.756，P<0.001)。IGF-1與MMP-2呈負相關(r=-0.582，P<0.001)。

3 討論

流行病學資料顯示，DM是世界上大多數國家終末期腎病(ESRD)的最主要原因，但其確切發病機制仍不明確，代謝紊亂、血流動力學異常、氧化應激、炎癥、遺傳背景等多因素均參與其中[7]。因此，如何干預這些因素和延緩其發生、進展過程是治療DN的關鍵。目前通過干預多種細胞生長因子、減少細胞外基質堆積成為DN治療的新熱點。

該研究中的免疫組化及Western blot檢測均顯示DM組IGF-1表達增加、MMP-2表達下調，推測IGF-1可能通過下調MMP-2，增加細胞外基質堆積，改變腎臟形態與功能，從而在DM腎臟損害過程中起作用。IGF-1作為一種細胞因子，可使大鼠系膜細胞增生，同時刺激系膜細胞合成大量Ⅳ型膠原等細胞外基質[8]。有研究[9]報道IGF-1在腎臟表達增加是導致STZ誘導的DM大鼠腎臟肥大和腎小球高濾過的原因之一，與DN的發生發展密切相關。細胞外基質的增生除與其合成增加有關外，還與其降解減少有關。MMP-2是降解Ⅳ型膠原的主要明膠酶，可以減少細胞外基質的沉積。該研究結果顯示在DM大鼠腎組織IGF-1與MMP-2的表達呈負相關關系，二者與24 h尿蛋白分別呈現正相關和負相關關系，進一步證實了二者在DN進展機制中的作用。

MMF作為一種新型、高效的免疫抑制劑已成功應用于腎移植領域，近年來，隨著對其藥理作用的不斷深入研究，MMF正逐步被應用于非移植腎臟疾病。MMF在體內代謝為霉酚酸(MPA)，MPA通過抑制次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶，耗竭細胞內的鳥苷酸池，干擾DNA的合成而發揮藥理作用，可以高效抑制淋巴細胞增殖、巨噬細胞活化。國內外研究[10-11]發現，MMF可以通過抑制炎癥細胞浸潤對實驗性DN發揮保護作用。MMF對DM大鼠腎臟IGF-1、MMP-2表達的影響國內外報道甚少。該研究結果顯示MMF早期干預STZ誘導的DM大鼠，可使腎臟IGF-1表達減少、MMP-2表達上調，在病理上可見腎小球肥大、系膜細胞及細胞外基質增生情況均較DM組改善。推測MMF通過下調IGF-1表達和上調MMP-2表達，從而抑制系膜細胞的增殖和系膜基質的沉積。

綜上所述，MMF對DN的保護作用可能部分與其減少IGF-1在腎臟的表達有關。隨著實驗的進展，將對其作用劑量和時效做進一步的分析及不良反應評估，以期為臨床治療DN提供新的思路和證據。

致謝：感謝趙瑛瑛、張文吉、張宛哲、孟晶茜、申鵬霄等老師在該研究的設計及實驗階段給予的支持和幫助，感謝河南省中醫學院第二附屬醫院動物實驗中心提供的標準化實驗設施及高水波老師給予的悉心幫助！

[1]蔡廣研，梁爽.臨床指標判定糖尿病腎病診斷與預后價值及局限性[J].中國實用內科雜志，2012，32(6)：405

[2]蔡明，王強，許亮，等.胰島素體循環回流和胰液腸引流式胰腎聯合移植手術技巧及圍術期處理[J].解放軍醫學雜志，2011，36(12)：1318

[3]Ji L，Yin XX，Wu ZM，et al.Ginkgo biloba extract prevents glucose-induced accumulation of ECM in rat mesangial cells[J].Phytother Res，2009，23(4)：477

[4]Yokoi H，Mukoyama M，Mori K，et al.Overexpression of connective tissue growth factor in podocytes worsens diabetic nephropathy in mice[J].Kidney Int，2008，73(4)：446

[5]吳文迅，陳香宇，王慶祝，等.糖尿病腎病大鼠腎臟組織中Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受體的表達[J].鄭州大學學報：醫學版，2011，46(2)：195

[6]李治國，張浩軍，焦亮，等.糖尿病腎病模型UCH-L1蛋白表達變化的研究[J].解放軍醫學雜志，2012，37(8)：783

[7]劉芳，付平.我國糖尿病腎病的基礎與臨床研究——2007年河南鄭州腎臟病年會熱點回眸與展望[J].鄭州大學學報：醫學版，2008，43(1)：14

[8]Isshiki K，He Z，Maeno Y，et al.Insulin regulates SOCS2 expression and the mitogenic effect of IGF-1 in mesangial cells[J].Kidney Int，2008，74(11)：1434

[9]Levin-Iaina N，Iaina A，Raz I.The emerging role of NO and IGF-1 in early renal hypertrophy in STZ-induced diabetic rats[J].Diabetes Metab Res Rev，2011，27(3)：235

[10]呂永曼，黃曉麗，易艷.霉酚酸酯對糖尿病大鼠腎間質細胞浸潤及腎組織ICAM-1和MCP-1 mRNA表達的影響[J].中華腎臟病雜志，2006，22(9)：576

[11]Kelly KJ，Dominguez JH.Treatment of the post-ischaemic inflammatory syndrome of diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant，2010，25(10)：3204