人臍帶間充質干細胞治療失代償期肝硬化的療效觀察

朱明慧，劉旭華，韓際奧，楊 柯，楊 璐，曹 巍#

1)鄭州人民醫院院士專家工作站 鄭州 450003 2)鄭州人民醫院檢驗科 鄭州 450003 3)鄭州人民醫院消化內科 鄭州 450003

肝硬化是多種慢性肝病的終末期病理表現，其藥物治療效果不理想。近年來，干細胞技術作為一種新的治療方法逐漸應用于臨床。雖然已有人臍帶間充質干細胞治療肝病并能改善肝功能的報道[1-2]，但治療對象、輸注途徑不盡相同。作者采用靜脈輸注人臍帶間充質干細胞治療失代償期肝硬化，觀察治療前后各項指標的變化，探討人臍帶間充質干細胞的臨床治療效果。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2010年10月至2011年12月在鄭州人民醫院消化內科行人臍帶間充質干細胞治療的失代償期肝硬化患者22例(觀察組)及同期住院未行人臍帶間充質干細胞治療的失代償期肝硬化患者20例(對照組)，均符合2000年病毒性肝炎防治方案診斷標準[3]，肝功能Child-Pugh分級為B或C級。所選擇病例均行腹部超聲或MRI檢查證實有肝硬化及腹水。觀察組中男18例，女4例，年齡24～67(48.5±10.6)歲；乙肝肝硬化17例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例。對照組中男16例，女4例，年齡26～66(49.2±11.9)歲；病毒性肝硬化17例，酒精性肝硬化3例。

1.2人臍帶間充質干細胞的采集、分離培養與鑒定該技術已經醫院倫理委員會審核通過。人臍帶間充質干細胞的采集：臍帶來自鄭州人民醫院產科分娩的健康孕婦，分娩前檢測HBV、HCV、HIV等病原學指標，并簽署知情同意書，建立健康檔案。操作時嚴格按照臍帶采集標準和要求進行。分離培養：將新鮮臍帶放入大培養皿中，PBS沖洗2遍，洗去血污；去除羊膜和血管，將剩余組織剪成1 mm3大小的組織塊，放入培養皿中，加入Alpha-MEM培養基20 mL；放入體積分數5%CO2培養箱中培養，培養第3天半量換液，此后每天觀察細胞并每隔3 d全量換液1次；細胞覆蓋培養皿達70%～80%時，加2.5 g/L胰蛋白酶消化、傳代。鑒定：用2 g/L臺盼蘭染色、計數，判斷細胞存活率，同時行細菌、真菌、支原體檢測和流式項目檢測，結果顯示所獲細胞不表達CD31、CD34、CD45，強烈表達CD29、CD44、CD73。將存活率95%以上、數量1.0×108個以上的間充質干細胞用生理鹽水100 mL重懸，制成細胞懸液。

1.3治療方法觀察組患者治療前均簽署知情同意書，且該技術的臨床應用已經醫院倫理委員會審核通過。治療前注射小劑量地塞米松預防過敏反應，觀察組每周靜脈輸注制備好的懸浮臍帶間充質干細胞1次；干細胞治療后當日起連續使用促肝細胞生長素3 d，連續輸注2周。2組患者常規治療基本一致，治療中根據情況進行支持性治療。

1.4療效觀察觀察2組患者治療前及治療后4、8周的臨床癥狀、體征；采用日立7600全自動生化分析儀檢測2組患者谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、白蛋白(albumin，ALB)、血肌酐(creatinine，CRE)和血氨(ammonia，AMM)等肝、腎功能；采用SYSMEX CA-1500全自動血凝儀檢測凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和凝血酶原活動度(prothrombin activity，PTA)；行腹部超聲或CT檢查。對照組5例、觀察組6例有各時間點完整生化指標檢測結果，2組各有8例有各時間點凝血指標檢測結果，10例有完整臨床癥狀及體征變化的記錄。

1.5統計學處理應用SPSS 13.0處理數據。2組治療前后各指標的比較采用重復測量數據的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組患者治療前后生化指標的比較見表1～3。

表1 2組治療前后AMM的變化 μmol·L-1

F組間=0.514，P=0.704；F時間=16.177，P=0.002；F交互=0.001，P=0.982。

表2 2組治療前后ALT和TBil水平的變化

ALT：F組間=0.001，P=0.978；F時間=52.672，P<0.001；F交互=4.297，P=0.033。TBil：F組間=0.063，P=0.804；F時間=4.832，P=0.015；F交互=1.140，P=0.319。

ALB：F組間=3.023，P=0.090；F時間=10.933，P<0.001；F交互=1.630，P=0.202。CRE：F組間=1.050，P=0.312；F時間=0.421，P=0.622；F交互=1.656，P=0.202。

2.2 2組治療前后凝血指標的比較見表4。

2.3 2組治療前后臨床癥狀及體征的變化觀察組中10例患者在干細胞治療后8周腹水明顯減少或消失，患者乏力、納差情況也明顯好轉；有2例患者治療前反復發生肝性腦病，治療后8周檢查，未再發生肝性腦病。而對照組治療前后臨床癥狀及體征改善不太明顯。見表5。

表4 2組治療前后PT和PTA水平的變化

PT：F組間=0.054，P=0.819；F時間=41.070，P<0.001；F交互=2.735，P=0.082。PTA：F組間=0.015，P=0.905；F時間=40.881，P<0.001；F交互=0.201，P=0.708。

表5 2組治療前后臨床癥狀及體征的變化例

組別時間n腹水乏力納差肝性腦病對照組治療前101010103治療后4周108662治療后8周106452觀察組治療前101010102治療后4周104341治療后8周102120

2.4不良反應觀察組患者均未發生嚴重不良反應及并發癥，僅有1例治療后出現低熱，體溫37.8 ℃，24 h內自行緩解。

3 討論

肝硬化是一種常見的慢性肝病，是由一種或多種原因引起的肝臟損傷，具體表現為肝細胞彌漫性變性壞死，繼而出現纖維組織增生和肝細胞結節狀再生，使肝變形、變硬而導致肝硬化[4]。肝硬化失代償期是肝病的終末期階段，通常藥物治療效果不太顯著，肝移植是治療終末期肝病最有效的方法，但存在器官供體缺乏、價格昂貴、移植后排斥反應多等弊病。

當前最有效的治療手段是再造出充滿活力的肝細胞，替代那些已經死亡、失去功能的細胞。近年來，間充質干細胞治療在很多領域顯示出較好的療效，如血液病、糖尿病足、神經及免疫系統疾病等，用于終末期肝病的嘗試亦越來越多。研究[5-6]證實間充質干細胞是一群中胚層來源的具有自我更新和分化能力的多能干細胞，在一定條件下可誘導分化為肝細胞，并具有正常肝細胞功能，如分泌尿素和ALB等。有報道[7-8]經鼠尾部靜脈移植一定數量的骨髓干細胞并不引起機體明顯的毒性反應，還可以歸巢至肝臟并分化成肝細胞，但其分化率報道不一。所移植間充質干細胞定居于肝臟，是否分化為正常肝細胞和卵圓細胞與肝臟是否受損傷有關，而與移植途徑和移植后的時間無明顯關系[9]。作者采用靜脈輸注人臍帶間充質干細胞治療終末期肝病，因為外周血循環移植創傷最小且操作簡單，能最大程度減輕患者痛苦，并通過干細胞的歸巢能力達到治療效果。

臍帶間充質干細胞來源廣泛，取材方便，對產婦及新生兒無損害；臍帶中的干祖細胞更原始，能體外大量擴增；不存在組織配型和免疫排斥反應。該研究中僅有1例患者出現發熱，充分證明臍帶間充質干細胞治療的安全性。

該研究結果顯示，治療后4周和8周，2組肝、腎功能指標如ALT、TBil、AMM及ALB水平等均有改善；凝血指標中PT縮短，PTA增加。此外，2組臨床癥狀和體征均有改善，且觀察組優于對照組，提示干細胞治療有效。

總之，采用干細胞治療后4、8周的療效觀察結果在一定程度上表明了干細胞治療的有效性和安全性，短期療效較好，長期療效如何還有待進一步觀察。雖然干細胞治療不能給肝病患者帶來治愈性的效果，但可以在很大程度上控制肝硬化的進展速度，提高肝硬化患者的生存質量。

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