解耦聯(lián)蛋白2在不同年齡大鼠脾、胸腺中的分布與表達(dá)

胡祥上 宮德正 易傳安 鄒 原 (懷化醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南 懷化 48000)

衰老又稱老化，是指生物體在其生命的后期所進(jìn)行的全身性、多方面、循序漸進(jìn)的退化過(guò)程，這種退化過(guò)程在整體水平、組織細(xì)胞水平及分子水平均有體現(xiàn)〔1〕。實(shí)驗(yàn)研究表明，由于機(jī)體免疫功能隨年齡下降，從而導(dǎo)致自身免疫疾病以及癌癥發(fā)生的增多〔2〕。解耦聯(lián)蛋白2(UCP2)屬于線粒體內(nèi)膜上質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)家族中的成員之一，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物多種組織，其誘導(dǎo)質(zhì)子漏的一個(gè)重要作用是減少線粒體ROS的產(chǎn)生。UCP2的高表達(dá)可預(yù)防氧化損傷，而抑制UCP2的表達(dá)則可在多種細(xì)胞類型中促進(jìn)氧化損傷〔3〕。本研究擬觀察不同年齡、生理狀態(tài)下大鼠脾、胸腺組織中UCP2表達(dá)與ROS含量的關(guān)系，探討UCP2在不同生理狀態(tài)下抗脾、胸腺組織氧化損傷與細(xì)胞衰老及免疫功能的關(guān)系與作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只〔由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，系清潔級(jí)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(遼)2002～0005〕，按年齡分為幼年組〔年齡21 d，體重(82±5)g〕、成年組〔年齡3個(gè)月，體重(181±12)g〕和老年組〔年齡18個(gè)月，體重(500±20)g〕，每組10只，不同組別動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫，自然晝夜。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，術(shù)前禁食12 h。

1.2 主要試劑 UCP2山羊抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))、HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司，美國(guó))、生物素化兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司，美國(guó))、正常兔血清(北京中山生物技術(shù)有限公司)、濃縮型SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、丙二醛測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、ATP生物試劑盒(碧云天生物試劑公司)。

1.3 方法 ①脾、胸腺組織中MDA、GSH含量的測(cè)定:取脾、胸腺組織各0.5 g，分別加入4.5 ml PBS制成10%勻漿，3 000 r/min離心15 min后取上清。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量。上述操作均在冰上進(jìn)行，用Bradford法測(cè)定蛋白含量。②脾、胸腺指數(shù)測(cè)定:術(shù)前禁食、禁水12 h，將大鼠斷頭處死，采用無(wú)菌方法取脾臟和胸腺，用電子天平稱重，并計(jì)算指數(shù)。③免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠脾、胸腺內(nèi)UCP2蛋白的表達(dá):分別取脾、胸腺組織大約1 cm×1 cm×1 cm，洗凈血污，除去結(jié)締組織。10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片(3～4 μm)，貼片(多聚賴氨酸掛片)后烤干。用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。常規(guī)脫蠟至水;3%過(guò)氧化氫甲醇室溫孵育15 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶反應(yīng);0.01 mol/L枸櫞酸熱修復(fù)抗原15 min;正常兔血清室溫封閉30 min;羊抗UCP2(1∶150)4℃孵育過(guò)夜;生物素化兔抗羊IgG(1∶150)，室溫孵育30 min;SABC 試劑(1∶100)室溫孵育30 min;新鮮配制0.05%DAB(含0.01%H2O2)顯色，適時(shí)用PBS終止反應(yīng)。以上各步驟間均用PBS-T(0.01mol/L PBS，0.05%Tween-20，pH7.4)清洗切片5 min×4次。乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片、光鏡下檢查并攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡大鼠脾、胸腺組織內(nèi)MDA含量的變化 MDA測(cè)定結(jié)果顯示，老年組大鼠脾、胸腺組織中MDA含量〔(14.21±0.81)、(4.22 ±0.26)nmol/mg〕明顯高于幼年組〔(13.18 ±2.38)、(2.35±1.05)nmol/mg〕和成年組〔(27.16±0.47)、(16.19 ±2.42)nmol/mg，P ＜0.01〕。

2.2 不同年齡大鼠脾、胸腺組織GSH含量的變化 不同年齡大鼠脾、胸腺組織GSH測(cè)定結(jié)果顯示，GSH在老年大鼠脾組織中含量較成年大鼠及幼年大鼠顯著下降〔(177.09±39.22)vs(285.36±5.01)、(378.85 ±43.23)mg/g，P ＜0.01〕，在老年大鼠胸腺組織中含量較幼年大鼠顯著下降〔(114.61±1.75)vs(225.30±4.54)mg/g，P ＜0.01〕與成年大鼠無(wú)差異〔(120.36±14.93)mg/g，P ＞0.05〕。

2.3 不同年齡大鼠脾、胸腺指數(shù)的變化 不同年齡大鼠脾、胸腺指數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，老年大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均下降〔(16.19±3.42)、(0.85±0.02)mg/g〕。老年大鼠胸腺指數(shù)明顯低于幼年組和成年組〔(2.35±1.05)、(0.32±0.04)mg/g，(4.22 ±0.26)、(0.24±0.06)mg/g，P ＜0.01〕。

2.4 不同年齡大鼠脾、胸腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞UCP2表達(dá)的變化 幼年組、成年組大鼠脾、胸腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)UCP2表達(dá)較少(幾乎無(wú)表達(dá))，而老年組大鼠脾、胸腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)UCP2表達(dá)較多。見(jiàn)圖1。

圖1 不同年齡組大鼠脾、胸腺細(xì)胞UCP2表達(dá)的免疫組織化學(xué)觀察(DAB，×400)

3 討論

MDA、GSH含量的變化 MDA、GSH含量的多少，均可以反映胸腺內(nèi)活性氧(ROS)水平〔4，5〕。體內(nèi)ROS的來(lái)源可分為內(nèi)源性和外源性兩方面，其中線粒體膜可產(chǎn)生各種各樣的ROS。ROS除了通過(guò)氧化損傷對(duì)細(xì)胞造成直接損傷外，還能啟動(dòng)一系列的衰老信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞衰老〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明老年大鼠脾、胸腺組織的抗氧化損傷能力降低。

隨年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的免疫功能發(fā)生紊亂并逐步衰退。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔7〕，衰老使老年人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫功能下降。衰老大鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力及巨噬細(xì)胞的吞噬功能均明顯下降〔8〕。IL-2和IL-6是反映機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，IL-2主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-2產(chǎn)生減少和IL-6水平異常升高均加速機(jī)體的衰老進(jìn)程〔9，10〕。目前研究認(rèn)為〔11〕，UCP2 可通過(guò)控制細(xì)胞ROS水平，反映在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫起重要作用。本研究結(jié)果，在生理狀態(tài)下隨大鼠年齡的增長(zhǎng)，脾、胸腺組織內(nèi)ROS含量增多，ROS含量增多對(duì) UCP2的表達(dá)有激活作用，UCP2的激活又反饋降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，從而延緩機(jī)體衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

研究顯示〔12，13〕，在許多細(xì)胞內(nèi)存在 UCP2-ROS 抗氧化系統(tǒng)，UCP2通過(guò)降低ROS產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。隨動(dòng)物年齡增加，體內(nèi)ROS含量增多，ROS含量對(duì)UCP2表達(dá)有激活作用〔14〕;UCP2的激活又可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量〔15〕。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年組大鼠脾、胸腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)UCP2表達(dá)較多，幼年組和成年組大鼠脾、胸腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)UCP2表達(dá)較少(甚至無(wú)表達(dá))。老年組大鼠脾、胸腺組織ROS增多，引發(fā)UCP2的表達(dá)增多;UCP2又可以降低ROS對(duì)細(xì)胞氧化損傷能力，從而對(duì)延緩機(jī)體由于細(xì)胞氧化損傷而引起的衰老有著積極意義。

目前，UCP2調(diào)節(jié)ROS的機(jī)制尚未完全明了，因此，UCP2與ROS、ROS與衰老之間調(diào)節(jié)及UCP2對(duì)免疫功能影響的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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