改良型磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型的構建

劉 銘 張 健 魏小蘭 陳婷梅 劉慶蕓

(安康職業技術學院附屬醫院，陜西 安康 725000)

人工關節置換術已經有100多年的歷史，是治療嚴重關節疾患、重塑關節功能的重要手段，是廣大關節患者的福音。然而，隨著關節置換例數的增多，假體晚期無菌松動的問題日趨嚴重，二次翻新治療給廣大患者無論是經濟還是精神上帶來嚴重的創傷〔1〕。因此，任何有效的通過非手術方式來預防和治療人工關節無菌松動這一晚期并發癥一直是關節外科的研究熱點。目前研究發現，導致無菌性關節松動主要原因是磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解〔2〕。本次實驗采用鹽結晶攜帶聚乙烯磨損顆粒置入部分去除小鼠顱骨外膜的顱頂處，建立骨溶解模型，探討其可行性，從而為人工關節松動的研究提供簡單、快捷、經濟、方便、實用性強的實驗學基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 實驗選用近交系雌性BALB/c小鼠30只，8～10周齡，體質量約20 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供;聚乙烯微粒購于美國 Zimmer公司，微粒直徑為2～3 μm，用70%乙醇溶液反復沖洗顆粒，并浸泡24 h后用生理鹽水洗去酒精，制成生理鹽水的懸浮液，濃度為10 mg/ml;TRAP試劑盒購于南京建成公司;電鏡日立-S-3000N，切片機德國LEICARM2135，OLYMPAS BX-50多功能顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 鹽結晶攜帶聚乙烯磨損顆粒磨的制備 5%生理鹽水2 ml和20 mg高分子聚乙烯顆粒充分混合，制成10 mg/ml濃度的鹽溶液。在常溫無菌環境下(超凈臺)自然蒸發5～7 d，鹽溶液結晶。搗碎后制成鹽包埋磨損顆粒結晶體，在電子秤上分別稱出10包鹽(51 mg/包)包埋聚乙烯磨損顆粒和純鹽晶體待置。

1.2.2 體內小鼠顱骨骨吸收模型的制作 30只清潔無菌小鼠，隨機分成三組，每組10只，生理鹽水組(A組)、純鹽組(B組)，C組，稱重并標記。制備4%水合氯醛，按照1 ml/100 g體重進行腹腔麻醉，麻醉成功后，小鼠頭部用脫毛劑給予充分脫毛，干凈后碘伏常規消毒，鋪一次性無菌巾，在小鼠顱頂矢狀線(垂直于小鼠雙側外耳道連線，并經過此連線的中點)用15號小圓刀或者小剪刀切開1 cm左右皮膚及皮下組織。在助手成功對小鼠頭部皮膚牽引下，充分暴露小鼠顱頂1 cm2左右范圍完整骨膜。在顱頂處，用小圓刀輕輕剝離或者15號小鑷子輕輕撕脫小鼠顱骨外膜，形成0.2～0.2 cm骨膜缺損區(一般無出血，有少量出血時，用無菌紗布輕拭即可)。其中A組用消毒微量取樣槍吸取50 μl 5%生理鹽水滴入骨膜缺損區即可;B組放入無菌鹽顆粒51 mg即可，C組放入51 mg鹽包埋磨損顆粒結晶體，對于C組和B組在放置鹽結晶物或者純鹽顆粒時，應盡量均勻放置在骨膜缺損區。然后用無菌、無損傷線縫合傷口。在整個手術過程中，小鼠眼睛用無菌紅霉素眼膏保護。模型構建成功后，待小鼠麻醉清醒后分籠飼養。術后常規給予青霉素抗炎2 d，預防感染。術后14 d分別處死各組小鼠，無菌環境下取顱骨頂處骨組織(此項操作中要求取出的顱頂骨以正中矢狀線為中心的環形區域)，取出標本用 PBS液沖洗，10%中性甲醛固定24 h，10%中性EDTA脫鈣液脫鈣14 d后蒸餾水沖洗70%酒精固定、石蠟包埋，切片機切片，連續三層切片，層厚6 μm(備用HE、TRAP染色)。對于送電鏡處取材小鼠，標本用生理鹽水沖洗3遍，4%戊二醛固定送入電鏡室專業處理。

1.2.3 骨溶解的觀察及計算 選定切片，行常規HE染色，在10×、20×及40×條件下觀察顱頂骨膜炎性反應和顱骨的表面侵蝕情況，以及骨組織細胞數量分布，每組選用3個標本進行觀察，每個標本采集5個不同的視野，采用Image ProPlus 6.0(IPP)圖像分析軟件測量正中矢狀線區域骨吸收溶解面積，并對骨外膜炎性反應細胞及骨組織內細胞計數。TRAP染色是破骨細胞的特異性染色。將切片按照TRAP試劑盒說明書進行染色，著色后破骨樣細胞呈棕紅色。Olympus電子顯微鏡20×、40×及100×條件下觀察，100×條件下攝像計算正中矢狀線區域的TRAP+細胞數量。

1.2.4 骨片掃描電鏡檢查 小鼠深麻醉后，快速取出新鮮小鼠顱骨標本用生理鹽水沖洗3遍，4%戊二醛固定2 h以上，再用OsO4固定1 h，生理鹽水沖洗3遍，單寧酸固定2 h以上，生理鹽水沖洗3遍，依次10%、30%、50%、70%、90%、100%酒精分別脫水15 min，再在30%、50%、70%、90%、100%叔丁醇中分別浸泡15 min以保護骨組織，4℃冰箱放置24 h后，放入液氮冷凍，干燥后真空噴吐金粉，在日立-S-3000N掃描電鏡下檢查小鼠顱骨表面的骨質吸收情況采用IPP圖像分析軟件對各組吸收陷窩面積進行計算分析，統計各組3個標本，每個標本在500～3 000倍視野下取5個不同視野進行陷窩面積計算，取平均值，計算其占視野面積的百分數。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.5統計軟件包進行單因素方差分析，數據均以s表示。

2 結果

2.1 HE染色結果 A組和B組骨表面溶解面積和骨內細胞數量統計結果無明顯差別，但B組骨膜炎性反應細胞略增高，無明顯統計學意義(P＞0.05);加入鹽包埋磨損顆粒結晶體混合物無論骨溶解面積還是骨膜反應以及骨組織內骨細胞明顯增多(見圖1);小鼠顱頂骨膜反應細胞滲出數結果 (個/視野):A組(1 540±368)、B組(1 610 ± 535)、C組(3 478±376)。骨組織內骨細胞數量(個/視野)A組(10±3)、B組(12±2)、C組(25±5)(這點與TRAP染色結果較為一致)。A組和B組骨表面溶解面積和骨內細胞數量統計結果無明顯差別，但B組骨膜炎性反應細胞略增高，但無明顯統計學意義(P＞0.05);加入鹽包埋磨損顆粒結晶體混合物后骨溶解面積、骨膜炎性反應細胞以及骨組織內骨細胞明顯增多(P＜0.01)。

2.2 TRAP染色結果 A組和B組未見明顯染色區域，僅有少許紅色區域，細胞數量少;C組顆粒組染色深，陽性染色面積區域大，細胞數量明顯增多，并可見較明顯骨吸收的情況。TRAP染色陽性細胞計數結果(個/視野):A組為(3.842 7±1.182 1)、B組為(4.026 1±1.37 2)、C組(17.325± 4.210 7)。A組與B組相比無明顯差別(P＞0.05);C組與A和B組比較:破骨細胞數量明顯增加，溶骨效應增強，差異顯著(P＜0.01)。見圖1。

2.3 小鼠顱骨電鏡掃描檢查 見圖2。A組和B組:骨纖維組織結構緊密，鈣丟失較少，未見明顯吸收陷窩;C組:陷窩形態多樣以圓形、橢圓形多見，同時可見臘腸型復合不規則性，骨吸收區凹陷形成巖溶現象;陷窩深淺不一，有些深的陷窩邊界清晰、底面粗糙、在陷窩中央可見片絮狀東西黏附，周圍及底部可見纖維紋路;有些陷窩較淺，僅有斑點狀骨質吸收區域，骨片表面粗糙、鈣丟失明顯，骨質疏松嚴重。IPP圖像軟件分析骨吸收區域與視野面積的百分比結果:A組(3.09±0.62)%、B組(3.25±0.78)%、C組(14.58±2.68)%，C組與A組、B組比較差異顯著(P＜0.05)。

圖1 各組小鼠顱骨組織病理圖片(×200)

圖2 各組小鼠顱骨組織電鏡觀察結果(SM，×200)

3 討論

面對日益增多關節關節置換、返修患者，我們亟待解決假體關節無菌關節松動這一難題。為此，我們需要建立一種簡單、經濟、真實、可操作性強的模擬的動物實驗模型作為基礎實驗平臺。

目前國內外在建立體外假體無菌松動急性骨溶解病理模型中，多采用小鼠背部皮下氣囊植骨模型〔3，4〕，該實驗模造模簡單、節約時間、易操作;模擬性強;實用性及敏感性好;其較強的氣囊壁炎性反應，能夠方便檢測磨損顆粒誘導各類炎性因子，進行細胞因子分析。但是，該實驗最大缺點是沒有骨組織的參與〔5〕，缺少血供、神經營養支持不能真實模擬磨損顆粒在體內誘導溶骨的真實環境，亦不能真實反映骨組織在重建中成骨細胞的修復和破骨細胞的溶骨的動態平衡〔6〕。同樣，對于溶骨現象，這種動物模型也無法考慮骨自身的修復作用，因此不能準確做出溶骨定量測定。

在磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型中，國內外多采用兩種方法:(1)皮膚縫合包埋法:這種方法在小鼠顱骨外膜外放置大量磨損顆粒后，皮膚縫合后完成。這種方法可行性強，也符合磨損顆粒誘導破骨細胞溶解骨組織致假體松動體內環境模擬。但這種實驗模擬需要大量磨損顆粒〔7〕，由于磨損顆粒價格高昂，需要大量實驗資金投入。同時，大量磨損顆粒在顱骨外膜蓄積，骨外膜及皮膚、皮下組織炎性反應強處，溶骨時間較短，不利于實驗進行及觀察。此外，由于小鼠顱骨皮膚及皮下組織與顱骨外膜組織疏松，在小鼠清醒活動時，大量磨損顆粒必然會沿著疏松的組織間隙向顱骨外膜周圍蔓延，甚至進入小鼠眼眶、上唇、頸部周圍，造成多處周圍組織損傷和粘連，取材組織易遭破壞，影響實驗結果。(2)磨損顆粒懸浮液顱骨外膜膜下注射法〔8，9〕:該法用微量注射器在顱骨表面注入顆粒懸液并均勻分布于骨表面。該法優點是需要磨損顆粒少，操作方便。但是由于高分子聚乙烯磨損顆粒密度低，很難配制均勻磨損顆粒混合液，取等量標準液時磨損顆粒量不均等，影響實驗結果觀察;另外，小鼠骨外膜組織特薄、疏松，注射液體時很易撐破骨外膜，并從進針口和撐破處溢出，實際留置在骨表面的顆粒懸浮液較少，因此不能產生很好溶骨效應;其次，小鼠顱骨板很薄，進針容易誤入顱內，造成小鼠腦組織損傷甚至死亡。

“鹽溶法”在進行本次小鼠顱骨溶解模型中建立中，首先在磨損顆粒(直徑為2～3 μm)〔10〕符合誘導溶骨條件的基礎上，利用鹽水和磨損顆粒混合后，自然條件下蒸發，得到鹽、磨損顆粒結晶體混合物，并把這種鹽混合結晶體放置在去部分顱骨外膜的顱頂處。由于鹽晶體的理化特性決定其溶解時和顱骨黏附較為緊密，在鹽溶解過程中逐漸把適量的磨損顆粒釋放出來，較為均勻地分布在顱骨外，達到直接放置磨損顆粒的目的;另外，在鹽晶體溶解過程中，周圍顱骨外膜會迅速長入，很快把磨損顆粒完全包埋在骨膜下，不會出現磨損顆粒向周圍蔓延現象。次外，由于鹽溶解周圍的高滲狀態，不利于細菌的生長，便于傷口修復。該實驗優點是需要磨損顆粒少、花費少、不易浪費、易操作，并且把顆粒直接和骨面接觸，更符合假體松動體內骨溶解環境。但是和上述構建模型一樣，此種模型沒有假體的植入，仍然屬于急性溶骨病理模型范疇。因此在研究松動的過程中并沒有考慮機械應力對松動的影響，這與人工關節松動發生的慢性溶骨過程是有差別的〔11〕。另外，在放入鹽磨損顆粒混合物時對小鼠傷口有部分痛刺激作用，因此要求對小鼠麻醉程度要求較高。總之，本實驗在磨損顆粒符合誘導溶骨條件的基礎上，通過HE、電鏡掃描、TRAP染色來觀察、分析骨膜炎性細胞滲出、骨破壞面積及破骨細胞數目變化表明小鼠顱骨發生了明顯的骨溶解、吸收現象，與人體內磨損顆粒誘導的骨溶解吸收表現非常相似。從總體而言，該實驗模型的設計克服了上述各模型的不足，更加簡潔方便、易操作，過程嚴謹可靠，結果合理有效，可信度高，值得推廣的一種基礎實驗方法。

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