hPEDF基因修飾對巨噬細胞條件培養基誘導RPE細胞增殖的影響

劉 姝 王霽雪 王瑩雪 吳雅臻 李亞萍 (吉林大學第二醫院眼科，吉林 長春 130041)

巨噬細胞和視網膜色素上皮(RPE)細胞是增殖性玻璃體視網膜病變(PVR)中的重要細胞組成成分。巨噬細胞廣泛存在于視網膜增殖膜中，在炎癥早期和傷口愈合過程中起重要的調控作用，能通過炎癥及免疫反應啟動和促進眼內細胞增殖。而RPE細胞是視網膜前細胞性膜形成中的主要效應細胞，其增殖常能導致牽拉性視網膜脫離，引發PVR形成。研究發現，巨噬細胞可促進RPE細胞增殖、移行〔1〕。本實驗觀察巨噬細胞條件培養基誘導RPE細胞及重組人色素上皮衍生因子(hPEDF)基因修飾的RPE細胞的增殖作用，對PEDF在PVR中的作用進行初步的體外研究。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗室已構建成功的含有hPEDF基因的真核表達載體pcDNA3-PEDF〔2〕。DMEM培養基、胎牛血清、G418為GIBCO公司產品。脂質體(Lipofectamine 2000)為Invitrogen公司產品。人RPE細胞株(D407)來自廣州中山細胞庫。抗hPEDF單克隆抗體為R＆D公司產品。通用型RT-PCR試劑盒為鼎國生物技術公司產品。淋巴細胞分離液為北京化學試劑公司產品;二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產品;噻唑藍(MTT)為Sigma公司產品，用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成5 g/L的溶液，過濾除菌備用。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞的培養和傳代 細胞凍存和復蘇:細胞約106，消化離心后棄上清液，加入凍存液(50%培養基+40%胎牛血清+10%DMSO)1 ml，放置于4℃ 2～3 h后改置于－80℃24 h，然后放入液氮中保存。復蘇時，將細胞自液氮中取出，37℃水浴迅速搖動溶解，培養瓶中預先加入37℃的培養液，將細胞懸液逐滴加入培養瓶中，搖勻充分混合，靜置5%CO2的37℃培養箱培養過夜。用含10%胎牛血清的DMEM培養人RPE細胞株，2～3 d傳代1次，于37℃ 5%CO2及飽和濕度環境中培養和傳代。

1.2.2 RPE細胞的G418最小致死劑量測定 24孔板接種適量的RPE細胞。細胞長至板底面積50% ～60% 時，加入含有不同濃度 G418(濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g/L)培養液。2～3 d換液1 次，10 d左右根據細胞死亡情況確定G418對于RPE細胞的最小致死劑量。

1.2.3 細胞轉染和篩選 (1)細胞準備:選取復蘇后第2代的RPE細胞進行轉染實驗。取旺盛生長期的RPE細胞以2×105個細胞/孔，接種六孔培養板，37℃ 5%CO2飽和濕度培養24 h，待其細胞密度(面積百分比)達到90%。(2)細胞轉染:無血清、無抗生素的細胞培養基加入轉染前的細胞，洗2次;A、B混合液(A液:10 μg PEDF質粒DNA+50 μl無血清培養液;B液:2 μl Lipofectamine 2000+50 μl無血清培養液;合并 A、B 液，置于室溫15 min)中加入0.8 ml無血清培養液，混勻后加入培養的細胞，在5%CO2的37℃培養箱放置6 h后棄轉染液，加入10%胎牛血清的DMEM繼續培養。(3)穩定表達PEDF基因的細胞克隆篩選:72 h后傳代，對照組和轉染PEDF的細胞以1∶10傳代，接種在60 mm的培養皿，加入含G418的選擇培養基，14 d后有明顯克隆形成，用胰酶消化法轉移細胞克隆，分別擴增培養。

1.2.4 轉染細胞PEDF的鑒定 選取RPE細胞(復蘇后第2代)和轉染后的RPE細胞，采用RT-PCR(引物:5'-ATG TCG GAC CCT AAG GCT GT-3';5'-CCC ATC CTC GTT CCA CTC AA-3')及免疫細胞化學染色檢測有無PEDF表達。

1.2.5 巨噬細胞條件培養基的制備 收集肝硬化腹水患者腹腔穿刺液2 L，離心后傾去上清后加入6 ml D-Hank液混勻，然后加于3 ml淋巴細胞分離液之上，2 000 r/min密度梯度離心。回收第2層白色膜狀層，D-Hank液洗滌3次，加入10%胎牛血清DMEM培養液，制成細胞懸液，置于75 ml培養瓶中，37℃ 5%CO2孵箱內孵育30 min，去除未貼壁細胞，加入含0.1%利多卡因的DMEM培養液孵育30 min，解除巨噬細胞貼壁，1 000 r/min離心5 min，DMEM洗滌2次，獲得高純度的巨噬細胞。經細胞計數后以1×106/ml接種于24孔培養板內，加DMEM(不含血清)至 1 000 μl，37℃ 5%CO2孵箱內孵育培養24 h，取上清，1 000 r/min離心5 min，－20℃保存備用。

1.2.6 MTT比色法 取培養的RPE細胞及重組hPEDF基因修飾的RPE細胞，以5×103個細胞/孔接種于96孔板內，37℃5%CO2培養箱中孵育48 h，細胞近融合時，吸出孔內液體，加入等量不含血清的DMEM 24 h，細胞生長同步化后，進行分組實驗。設立正常對照組和實驗組。實驗組分別加入巨噬細胞條件培養基，濃度分別為12.5%、25.0%、50.0%的體積分數。液體總量200 μl/孔，分別培養24、48、72 h，作用時間完成后，每孔加入MTT溶液20 μl，37℃ 5%CO2繼續孵育4 h，終止培養。吸出孔內全部液體，每孔加入150 μl DMSO，室溫下搖晃震蕩30 min，使結晶完全溶解，于酶標儀上570 nm波長處以空白孔調零，測各孔OD值。每一濃度設8個平行孔。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據以s表示，采用方差分析、q檢驗。

2 結果

2.1 RPE細胞對G418的耐受試驗 加入G418后第4天，高濃度(0.7～1.1 g/L)孔內出現細胞死亡脫落現象;第12天，0.3 g/L濃度孔內可見少數細胞存活生長，0.4 g/L及以上濃度孔內均無細胞生長。因此，0.4 g/L G418可作為RPE細胞neo基因的篩選濃度。

2.2 轉染細胞的篩選 轉染后的RPE細胞加入含0.4 g/L G418的選擇培養基，14 d后有明顯克隆形成，用胰酶消化法轉移細胞克隆擴增培養。

2.3 轉染前后RPE細胞形態觀察 穩定表達PEDF的RPE細胞株表現出類似原代RPE細胞的形態，細胞排列致密，大量色素分布于細胞質內，圍繞細胞核。而未轉染的PRE細胞呈均一透明的梭形。見圖1。

2.4 轉染細胞PEDF表達的RT-PCR檢測結果 提取的RPE細胞總RNA，OD260/OD280為1.8～2.0，說明提取的RNA純度較高;1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見清晰的28 S和18 S亞基泳帶(圖2)，表明所提取的RNA完整，可用于進一步實驗。在沒有轉染的細胞中，未檢測到PEDF mRNA特異性的表達條帶，pcDNA3-PEDF質粒轉染后的RPE細胞內檢測到PEDF mRNA的表達，RT-PCR產物凝膠電泳，可見PEDF mRNA特異條帶出現。見圖3。

2.5 免疫細胞化學染色結果 pcDNA3-PEDF轉染的RPE細胞經G418篩選后，在蓋玻片上培養24 h，采用免疫細胞化學染色鑒定表達PEDF的轉染RPE細胞，結果顯示RPE細胞內有PEDF陽性表達。見圖4。

2.6 MTT分析結果 巨噬細胞條件培養基可誘導RPE細胞增殖，作用24、48、72 h后，各個濃度的實驗組OD值較之相應時間的對照組均不同程度增加(P＜0.01);巨噬細胞條件培養基亦對重組hPEDF基因修飾的RPE細胞的增殖有誘導作用，除巨噬細胞(12.5%)24 h組外，其余各個濃度的實驗組較之相應時間的對照組均不同程度地引起OD值增加(P＜0.01或P＜0.05)。重組hPEDF基因修飾的RPE細胞及未轉染的RPE細胞在無巨噬細胞條件培養基誘導的情況下，僅于培養72 h兩組間OD值差異有顯著性(P＜0.05)。應用不同濃度的巨噬細胞條件培養基誘導重組hPEDF基因修飾的RPE細胞及未轉染的RPE細胞相應時間的實驗組之間比較，OD值有顯著性差異(P ＜0.01)。見表1，表2。

圖4 免疫細胞化學染色結果(×200)

表1 不同濃度巨噬細胞條件培養基下RPE細胞的OD值變化(s)

表1 不同濃度巨噬細胞條件培養基下RPE細胞的OD值變化(s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01

0.208±0.020 0.217±0.013 0.229±0.013巨噬細胞(12.5%)0.251±0.0181)0.270±0.0241)0.296±0.0181)巨噬細胞(25.0%)0.276±0.0271)0.307±0.0311)0.321±0.0211)巨噬細胞(50.0%)0.273±0.0101)0.303±0.0201)0.323±0.0221)24 h 48 h 72 h正常對照組組別

表2 不同濃度巨噬細胞條件下培養基下重組hPEDF基因修飾的RPE細胞的OD值變化(s)

表2 不同濃度巨噬細胞條件下培養基下重組hPEDF基因修飾的RPE細胞的OD值變化(s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

0.203±0.011 0.209±0.032 0.216±0.018巨噬細胞(12.5%)0.220±0.041 0.235±0.0221)0.251±0.0172)巨噬細胞(25.0%)0.249±0.0222)0.264±0.0252)0.289±0.0332)巨噬細胞(50.0%)0.251±0.0112)0.269±0.0372)0.290±0.0202)24 h 48 h 72 h正常對照組組別

3 討論

巨噬細胞是PVR形成過程中的細胞因素之一，主要來源于血液、RPE細胞及玻璃體細胞等，在PVR的發病中有著重要作用。首先巨噬細胞是普通炎癥反應中較早出現的炎細胞，主要負責吞噬細胞的碎片;其次巨噬細胞還可以產生許多炎前性因子，如:腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細胞介素(IL)-1β，IL-6和IL-8等〔3〕，這些細胞因子釋放到玻璃體視網膜面，促使細胞外基質產生和沉著，組成可收縮的視網膜前膜成分。

目前認為PVR是眼組織損傷后的一種超常炎癥和修復反應。巨噬細胞在損傷修復過程中是必需的，它分泌多種細胞因子和生物活性物質，刺激炎癥反應，調控組織修復。在PVR眼的玻璃體液和視網膜下液內檢測到多種細胞因子和生長因子，在PVR膜上也檢測到許多因子的受體，其中許多因子都是由巨噬細胞分泌的〔4，5〕。體外實驗證實，巨噬細胞分泌的物質有促進纖維增生和血管再生的功能，巨噬細胞條件培養液有類似于表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-I等幾種細胞因子促進RPE細胞增生〔6〕的作用。動物實驗發現，玻璃體注入巨噬細胞可導致牽引性視網膜脫離，加快PVR形成，巨噬細胞參與了炎癥、免疫和損傷修復等病理過程。因而，巨噬細胞介導的炎癥反應被認為是PVR中細胞增生的必要條件。

RPE細胞增殖并形成膜是PVR形成的原因，RPE細胞是PVR視網膜前膜最重要的細胞成分。在正常生理狀態下，RPE細胞處于靜止狀態(G0期)不發生增殖;在PVR形成過程中，RPE細胞從原位靜止的狀態進入細胞周期并開始增殖，發生了一系列改變:RPE細胞遷移、增生、形態變化、產生并表達多種蛋白、合成細胞外基質、纖維瘢痕化等。使RPE細胞重新進入細胞周期的刺激信號還不清楚，可能與細胞間的相互作用產生了誘發細胞增生的分子信號及自分泌，以及對生長因子反應增強等因素有關。因此，以細胞周期阻滯為著眼點，將RPE細胞阻滯在G0期，阻止其重新進入細胞周期，從而抑制細胞增殖的發生，可能是抑制PVR形成的有效途徑。

研究表明PEDF是依賴年齡以及細胞周期特異性轉錄的細胞因子〔7〕，PEDF的表達與細胞增殖密切相關。在G0期細胞中PEDF mRNA的表達和蛋白質的分泌明顯高于快速增殖的細胞，PEDF可以抑制細胞進入DNA合成期(S期)，使細胞停滯在G0期，從而阻斷有絲分裂、細胞增生，誘導分化發生〔8〕。

本研究結果表明，巨噬細胞條件培養基可誘導RPE細胞的增殖，而重組hPEDF基因修飾則可以抑制巨噬細胞條件培養基誘導的RPE細胞的增殖作用。提示PEDF可能在PVR形成過程中起到一定的抑制作用，但其具體機制還有待于進一步的研究。

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