自體骨髓間充質干細胞移植對急性心肌梗死后心功能不全家兔基質金屬蛋白酶-9的影響

李樹仁 王天紅 劉東霞 張素巧 喬建晶 胡 煒 荀麗穎 郝淸卿 苑可心 吳 迪 董 潔 齊曉勇

(河北省人民醫院心臟內科，河北 石家莊 050051)

基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達和活性的增加，在急性心肌梗死(AMI)后心室重塑過程中具有重要的推動作用〔1，2〕。近來，應用選擇性MMPs抑制劑緩解左室擴張，減輕心肌梗死后心室重塑，取得了一定成果，抑制MMPs表達可能將成為AMI后防治心室重塑的新途徑〔3〕。最近又發現骨髓間充質干細胞(BMSCs)也可以抑制MMPs表達，緩解左室擴張，減輕心肌梗死后心室重塑〔4，5〕。目前，多數BMSCs移植主要從細胞增殖及機械功能角度分析心功能及毛細血管再生情況。而對于BMSCs歸巢后是否通過改變MMPs的表達影響對周圍間質纖維化重塑研究較少。因此，進一步明確BMSCs對心肌梗死后抑制心室重塑的影響有可能揭示BMSCs治療心肌梗死的新機制。本實驗通過復制家兔心肌梗死后心衰模型，觀察BMSCs移植后MMP-9、核轉錄因子-κB(NF-κB)及心功能的變化，探討BMSCs移植影響梗死后心室重塑的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 5月齡健康雄性新西蘭白兔34只，體重1.8～2.3 kg，隨機分為假手術組、AMI后心衰模型組、BMSCs移植組。組間體重差異無顯著性(P＞0.05)。以上動物均由河北醫科大學實驗動物中心提供(許可證號:SCXK冀2008-1-003)，實驗家兔依照美國國立衛生研究所頒布的《實驗動物飼養和使用指南》(NIH publication No.23-85，revised 1996)受到良好對待。實驗試劑:低糖DMEM培養基胎牛血清(美國hyclone公司);Percoll原液(美國Pharmacia公司);DAPI(瑞士Roche公司);5-氮胞苷(美國SIGMA公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養、誘導及標記 取雄性新西蘭白兔，在股骨處，予2%利多卡因局麻后，用骨穿針垂直刺入骨髓腔，外接肝素(250 U，1 ml)潤洗過的10 ml無菌注射器，抽取5 ml骨髓，放入10 ml離心管中，加等量DMEM液稀釋。梯度密度離心法及貼壁法分離、提取、培養BMSCs。于移植前2 h用含DAPI(50 μg/ml)標記培養基繼續培養2 h。移植前使用PBS洗6遍。最后收集1×107BMSCs用DMEM濃縮至1 ml，移植備用。取一滴DAPI標記過的BMSCs于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察DAPI標記情況。

1.2.2 兔AMI后心衰模型的制備和BMSCs移植

1.2.2.1 兔AMI后心衰模型的建立 兔稱重后，仰臥于手術臺，經兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉1 ml/kg麻醉后，剪除胸毛、消毒鋪無菌洞巾，沿胸骨正中線第2，3肋間稍偏左切皮，做長約3 cm切口，分離肋間肌、剪斷肋骨、剪開心包暴露心臟，用6/0醫用無損傷縫扎左冠狀動脈前降支中段緊鄰第一對角支處，觀察心電圖動態變化。心電圖可見相應導聯ST段抬高，同時肉眼觀察結扎區域心肌變白為結扎成功，逐層關胸，縫合切口。術后3 d肌注青霉素80萬U預防感染。術前及術后2 h記錄體表心電圖。

1.2.2.2 細胞移植 AMI術后14～21 d，仍以3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈麻醉兔子二次開胸，再次行胸骨左側切口打開胸腔，暴露心臟，選取心肌梗死周邊區域4個注射點，分別注射PBS液及BMSCs懸液。每點注射體積0.25 ml，注射位置以6/0手術線標記。3/0手術線關胸。術后分籠精心飼養，術后3 d肌注青霉素80萬U預防感染。

1.2.3 超聲心動圖左心功能測定 采用美國惠普公司5500型彩色多普勒超聲心動圖儀在術前、AMI后7 d、細胞移植后28 d分別由同一專科醫生進行超聲心動圖檢測。二維記錄胸骨旁左室長軸、短軸和心尖兩腔、四腔圖像，與左室長軸和短軸切面記錄M型曲線。重點測算左室舒張末內徑(EDD)、左室射血分數(EF)、短軸縮短率(FS)，所有測量值均取3次測量的平均值，由超聲心動圖醫生進行操作。

1.2.4 取材 各項檢測完成后，各組動物飼養至細胞移植后4 w，在全身麻醉下再次開胸，心內注射10%氯化鉀2 ml使心臟停搏于舒張期，迅速取下心臟，冰鹽水沖洗干凈，在相應梗死周邊區切取標本，置入液氮罐冷凍保存備用。

1.2.5 ELISA法測血清MMP-9的濃度 分別于術前、心梗后7 d、細胞移植后28 d(處死前)經耳緣靜脈抽血2～3 ml，避免溶血，抗凝劑用EDTA，2 000 r/min離心8 min，取上清－20℃保存，采用ELISA檢測血清MMP-9的濃度。試劑盒由美國ADL公司提供，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.6 采用RT-PCR的方法檢測心肌組織NF-кB、MMP-9 mRNA表達 試劑:RNA提取試劑Trizol Reagent為Invitrogen公司產品;逆轉錄酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、Taq DNA聚合酶、隨機引物、瓊脂糖為美國Promega公司產品;熒光定量試劑盒:Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I)，BBI公司。

RNA提取:取約100 mg組織于冰浴勻漿器中，加入1 ml Trizol(Invitrogen，USA)，迅速研磨成勻漿液，加入 200 μl氯仿，震蕩 30 s，冰上放置 5 min。4℃，12 000 r/min，離心 10 min，取上層水相轉移至另一1.5 ml離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，－20℃ 靜置 2 h。然后 4℃，12 000 r/min，離心20 min，棄 上 清，加 入 1 ml 75% 乙 醇，輕 輕 混 勻，4℃，12 000 r/min，離心10 min，吸凈上清液，于室溫下晾干，加入20 μl DEPC處理的去離子水溶解沉淀。反轉錄(RT):(試劑盒:Promega，USA)42℃ RJ 50 min，95℃ 5 min滅活反轉錄酶。Syber Green熒光定量PCR檢測:〔Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I)，BBI〕。儀器型號:ABI 7300 Real-Time PCR System，美國ABI公司。PCR熱循環參數:96℃ 4 min，然后三步反應:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行 40 個循環，于每個循環的第三步即:72℃ 30 s收集熒光信號。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。

各基因引物序列:NF-κB:擴增片段長度:121 bp，上游引物:5'TACGGCTTCCCACACTATGG3';下游引物 5'TCACAACATCCAGGGTCAGT3';MMP-9:擴增片段長度:71 bp，上游引物:5'CAGCGAAAGACTCTACACCCA3'，下游引物 5'CCTGGAAGATGAACGGAAACTC3';GAPDH:擴增片段長度:92 bp，上游引物:5'CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG3'，下游引物5'CACTGTTGAAGTCGCAGGAG3'。

1.2.7 BMSCs形態變化的觀察 取誘導培養4 w BMSCs，取生長旺盛的細胞經消化、離心成團塊(小米粒大小)，2.5%戊二醛固定2 h，1%餓酸固定1 h，梯度乙醇脫水，812樹脂包埋，Leica UCT超薄切片機切片，日立H-7500透射電鏡超微結構觀察。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件包進行統計學處理。計量資料以s表示。多組資料之間的比較采用單因素方差分析，多組間均數對比采用q檢驗。

2 結果

2.1 BMSCs形態觀察 通過Percoll密度梯度離心，大部分細胞于12 h貼壁，可獲得BMSCs。72 h可見貼壁生長以分散、克隆集落方式增殖，少量細胞拉長呈紡錘形緊貼培養瓶底部生長繁殖，其中懸浮不貼壁生長的圓形細胞為幼稚血細胞，在培養過程中通過全量換液絕大部分被棄除。5～7 d后細胞開始快速增殖，集落逐漸增大。11～14 d細胞集落間出現相互融合，細胞鋪滿單層，呈旋渦狀排列。大部分呈長梭形，少數三角形、多角形。密集處中心的細胞由多邊形轉變為梭形。胞核較大，多為卵圓形，也有圓形、不規則形，其中可見處于分裂期的核仁，胞體肥大，胞質豐富，大多數細胞有偽足。誘導后細胞的透射電鏡觀察:誘導后的細胞中可見到兼有BMSCs和肌細胞特點的過渡類型的細胞其電鏡特點為:胞核不規則，核膜有皺褶，海綿狀核仁大且明顯，位于胞核中央。細胞器比較豐富，除線粒體及粗面內質網外，還可見到肌絲團樣結構和Z線物質，構成類似原始的肌小節樣結構。熒光顯微鏡下觀察DAPI標記的BMSCs:經DAPI標記2 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到DAPI標記的BMSCs。細胞移植28 d后，處死家兔后，取梗死周邊區域組織，經冰凍切片機切片后，在熒光顯微鏡下可觀察到的經DAPI標記的移植BMSCs。見圖1。

2.2 家兔AMI后心力衰竭模型的建立 一般狀況:34只新西蘭白兔完成了手術，處死前有24只成活。其中對照組8只全部存活;AMI后心衰模型組存活8只，死亡4只;BMSCs組存活8只，死亡6只。共10只動物死亡，4只于結扎冠狀動脈LAD后誘發室顫死亡，2只于心梗模型制作成功后呼吸驟停死亡，另外4只于二次開胸細胞移植后24 h內死亡。

心電圖改變:結扎冠狀動脈LAD后，心電圖的胸導聯出現T波高尖、ST段抬高，Ⅱ、Ⅲ導聯出現T波倒置、ST段壓低。隨著梗死時間的延長ST段逐漸升高，2 h時ST段抬高的幅度為(0.23 ±0.14)mv。

心臟超聲檢查結果:①通過心臟超聲檢查發現術前家兔心臟各項指標均正常。與對照組相比，術后7 d AMI后心衰模型組及BMSCs組，家兔前壁室壁運動減弱，個別動物前壁室壁無運動。②術前各組的EDD、EF、FS均無顯著性差異。AMI后心衰模型制作后7 d:AMI后心衰模型組、BMSCs組的EF值比對照組降低(P＜0.05);AMI后心衰模型組、BMSCs組的組間EF值差異無統計學意義。③細胞移植后28天，正常對照組、BMSCs組EDD均明顯低于AMI后心衰模型組(P＜0.05)，EF及FS均明顯高于AMI后心衰模型組(P＜0.05)。見表1。

2.3 血清MMP-9濃度檢測結果 對照組與AMI后心衰模型組、BMSCs組的血清MMP-9濃度在手術前無顯著差異(P＞0.05);手術后7 d，與正常對照組相比AMI后心衰模型組、BMSCs組的血清MMP-9的濃度均顯著增加(P＜0.05);細胞移植后28 d，BMSCs組的血清MMP-9的濃度比AMI后心衰模型組顯著降低(P＜0.05)，正常對照組略低于BMSCs組，但無顯著性差異。見表2。

2.4 心肌組織MMP-9及NF-κB的RT-PCR檢測結果 細胞移植后28 d，與正常組相比，AMI后心衰模型組、BMSCs組的MI邊緣區的MMP-9及NF-κB的表達均顯著增加(P＜0.05);BMSCs組MMP-9及NF-κB比AMI后心衰模型組表達顯著降低(P＜0.05)。見表3。

表1 各組兔心功能測定(n=8，s)

表1 各組兔心功能測定(n=8，s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05，下表同

組別 EF(%)術前 AMI后7 d 移植后28 d 8 34.5±3.1 13.5±1.0 14.0±1.4 13.9±1.0 AMI后心衰模型組 71.4±4.1 51.6±4.51)57.1±5.51) 33.6±3.5 23.5±3.71)23.5±4.81)2)13.2±1.0 17.0±1.31)16.7±1.11)BMSCs組 72.4±5.4 52.6±4.01)2)67.0±5.81)2)34.9±3.9 25.5±4.41)31.0±5.91)2)13.5±1.1 17.6±1.41)2)14.7±1.41)2)28 d對照組 73.8±3.4 68.3±1.4 70.5±3.6 36.1±2.9 34.1±2.FS(%)術前 AMI后7 d 移植后28 d EDD(mm)術前 AMI后7 d 移植后

圖1 BMSCs形態觀察

表2 各組兔血清MMP-9測定結果(n=8，s)

表2 各組兔血清MMP-9測定結果(n=8，s)

42.8±11.2 62.6±11.2 63.0±9.5 AMI后心衰模型組 55.4±22.6 89.7±28.81) 80.7±7.41)BMSCs組 42.8±11.9 90.8±26.81)2) 58.9±4.21)2)28 d對照組組別 術前 AMI后7 d 移植后

表3 移植后28 d兔心肌組織MMP-9及NF-κB 水平( s，n=8)

表3 移植后28 d兔心肌組織MMP-9及NF-κB 水平( s，n=8)

組別 MMP-9 NF-κB 1.648±0.676 0.092±0.066 AMI后心衰模型組 5.538±2.3371) 1.331±0.5201)BMSCs組 2.479±1.7871)2) 0.593±0.4751)2)對照組

2.5 心功能與心肌組織MMP-9、NF-κB的相關性 細胞移植后28 d時，EF與血清 MMP-9呈負相關(r=－0.501，P=0.013)，與心肌組織MMP-9呈負相關(r=－0.822，P＜0.001)，與心肌組織NF-κB呈負相關(r= －0.866，P＜0.001)。

3 討論

心室重塑是AMI后發生慢性心力衰竭的主要病理基礎，是MI后心力衰竭及死亡的最主要原因，通過減緩或抑制不利的心室重塑過程可以改善MI后心臟的功能〔6〕。研究表明，AMI后MMPs的表達在梗死愈合、基質降解、細胞移行以及心室重塑方面起重要作用〔1，2，7〕。研究表明骨髓干細胞移植后可以改變AMI后心室重塑過程中MMPs的活性，從而減輕左室重構，明顯改善整個左心室幾何形狀，使AMI后的左室射血分數提高〔8，9〕，但其機制目前尚不完全清楚。

本研究說明移植的BMSCs一定時間內在梗死邊緣區的存活對改善心功能起者一定作用。AMI時，心肌壞死引起劇烈的炎癥反應。梗死區炎癥細胞浸潤，釋放大量炎癥因子(包括TNF-α)，刺激梗死區單核巨噬細胞和成纖維細胞釋放MMPs，心肌壞死為不可逆過程，梗死區的修復主要靠瘢痕的形成，如早期MMPs分泌過多，不利于瘢痕修復，梗死區心肌軟化，AMI時心室舒張末期壓力升高，這就使梗死區與非梗死區的矛盾運動更明顯，加劇了梗死后的心室重塑。BMSCs本身可分泌多種細胞因子〔8，10〕，這些因子中，有的具有抗心肌細胞凋亡作用，這就使TNF-α等炎癥因子減少，炎癥細胞如單核巨噬細胞和成纖維細胞減少，其釋放的MMPs也會減少，從而阻止膠原蛋白網被降解，相對增加膠原沉積和纖維化，改變基質重構，有利于心功能改善。TNF-α可影響MMP表達。Wang等〔11〕研究了充血性心衰患者血漿TNF-α水平與心肌MMP-2，3，9表達相關性。TNF-α增加了人心房成纖維細胞增殖和 MMP-9分泌。Xie等〔12〕研究了MMP-2和MMP-9的表達調控以及成體大鼠心臟成纖維細胞的激活與IL-1β的相關性，發現ERK1/2和JNKs的激活對MMP-9的表達和激活起重要作用;NF-κB的激活刺激了MMP-2和MMP-9的表達。前期研究也發現BMSCs移植可以減輕 MI后的炎癥反應〔8〕。

細胞外基質(ECM)的重塑在左心室重塑過程中發揮著重要作用。ECM的減少、降解和成分的變化加重了左心室擴張和破裂。MMPs是心室重塑過程中心臟基質降解的主要因素，其活性升高可引起纖維膠原降解增加、細胞外基質重構和心室擴張，其對心室重塑發生起著決定性作用〔13〕。MMP-9是 MMPs中重要的一種，具有高度保守的依賴于鋅離子的內切蛋白水解酶，可降解基底膜和細胞外基質的大多數蛋白質。Rohde等〔14〕證明經廣譜MMPs抑制劑處理的豬MI模型與對照組相比，舒張末期容積和收縮末期容積均減小。表明在梗死后重構的調節過程中非膠原因素起決定性的作用。應用選擇性MMPs抑制劑緩解左室擴張，減輕MI后心室重塑，可能將成為今后AMI治療的新途徑。Li等〔15〕也發現同樣BMSCs移植減少宿主心肌間質Ⅰ型和Ⅲ膠原表達。這提示在梗死后心肌組織中，通過MMPs的上調及TIMPs的下調調節了膠原為主的細胞外基質成分的變化，影響了梗死后心室重塑的病理過程;而骨髓干細胞移植的移植則抑制或逆轉了這種變化，表現為MMPs的下調及TIMPs的上調，繼發引起膠原量的減少，從而阻止或逆轉了心室重塑的發展。

本研究發現:在梗死周圍區域BMSCs移植組的MMP-9的mRNA水平較AMI后心衰模型組明顯降低，通過心臟超聲檢查我們也發現BMSCs移植組心功能較AMI后心衰模型組明顯改善，提示MI后在心肌組織中，通過MMP-9的上調，調節了以膠原為主的細胞外基質成分的變化，影響了梗死后心室重塑的病理過程;而BMSCs的移植則抑制或逆轉了這種變化，表現為MMP-9的下調，繼發引起膠原量的減少，從而阻止或逆轉了心室重塑的發展。本實驗還說明BMSCs移植也同樣減輕了血液中MMP-9的濃度，與上述結論一致。綜上表明BMSCs移植可以減輕MI后MMP-9的表達，BMSCs通過減輕MMPs的表達也可能是BMSCs移植治療MI后心衰的重要機制之一。

NF作為信號轉導途徑中的一環，負責細胞內的信息交流及綜合，作用于膠原基因的調控，在組織器官纖維化形成中有意義。NF-κB是最重要核轉錄因子之一，其作為信號轉導途徑中的樞紐，與多種生理、病理作用有關，分泌白細胞介素、腫瘤壞死因子、細胞黏附分子、干擾素等炎性介質，產生急性炎癥反應。NF-κB是靜息狀態下以失活狀態存在于細胞質中，在外界因素刺激下，NF-κB得以激活并移位進入細胞核，啟動基因轉錄〔16〕，激活基質金屬蛋白酶基因的轉錄。

有研究證明，在心臟重構中起中心作用的MMP-9，其轉錄直接由 NF-κB 調控〔17，18〕，在梗死后重構過程中，通過抑制 NF-κB，直接或通過抑制炎癥反應間接導致MMP-9表達的減少，對細胞外間質重構起有益的作用〔2〕。本文發現:BMSCs移植后可抑制了梗死周圍區NF-κB的表達，BMSCs心肌移植后，可能通過抑制NF-κB由細胞核外移至核內的激活及減輕炎癥反應，從而抑制MMPs的表達，導致膠原等細胞外基質的變化，抑制了膠原的合成及沉積，從而阻止了梗死后的心室重塑。

1 Jugdutt BI.Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix:when is enough enough〔J〕?Circulation，2003;108(11):1395-403.

2 Trescher K，Bernecker O，Fellner B，et al.Inflammation and postinfarct remodeling:overexpression of IκB prevents ventricular dilation via increasing TIMP levels〔J〕.Cardiovasc Res，2006;69(3):746-54.

3 Jiang B，Chen J，Xu L，et al.Salvianolic acid B functioned as a competitive inhibitor of matrix metalloproteinase-9 and efficiently prevented cardiac remodeling〔J〕.BMC Pharmacol，2010;10:10.

4 Okada M，Yamawaki H，Hara Y.Angiotensin II enhances interleukin-1 beta-induced MMP-9 secretion in adult rat cardiac fibroblasts〔J〕.J Vet Med Sci，2010;72(6):735-9.

5 張 瑤，李永俐，李麗麗，等.骨髓間質干細胞移植對心力衰竭大鼠心室重構影響的實驗研究〔J〕.中華心血管病雜志2009;37(4):347-51.

6 Brower GI，Gardner JD，Forman MF，et al.The relationship between myocardial extracellular matrix remodeling and ventricular function〔J〕.Eur J Cardio-thoracic Surg，2006;30(4):604-10.

7 Peterson JT，Li H，Dillon L，et al.Evolution of matrix metalloprotease and tissue inhibitor expression during heart failure progression in the infarcted rat〔J〕.Cardiovasc Res，2000;46(2):307-15.

8 李樹仁，齊曉勇，胡福莉，等.兩種骨髓間充質干細胞移植改善豬心室重構機制的研究〔J〕.中華醫學雜志(英文版)，2008;121(23):2403-9.

9 Rossini R，Senni M，Musumeci G，et al.Prevention of left ventricular remodeling after acute myocardial infarction:an update〔J〕.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2010;5(3):196-207.

10 李樹仁，齊曉勇，張建青，等.不同類型的骨髓間質干細胞移植改善心梗的心室重構〔J〕.中國組織工程與臨床康復，2008;12(47):9371-7.

11 王先梅，楊麗霞，祝善俊.腫瘤壞死因子α和基質金屬蛋白酶家族與左室重構的關系〔J〕.中華內科雜志，2004;43(11):823-31.

12 Xie Z，Singh M，Singh K.Differential regulation of matrix metalloproteinase-2 and-9 expression and activity in adult rat cardiac fibroblasts in response to interleukin-1beta〔J〕.J Biol Chem，2004;279(38):39513-9.

13 Creemers E，Cleutjens J，Smits J，et al.Matrix metalloproteinase inhibition after myocardial infarction:a new approach to prevent heart failure〔J〕?Circ Res，2001;89:201-10.

14 Rohde LE，Ducharme A，Arroyo LH，et al.Matrix metalloproteinase inhibition attenuates early left ventricular enlargement after experimental myocardial infarction in mice〔J〕.Circulation，1999;99(23):3063-70.

15 Li L，Zhang Y，Li Y.Mesenchymal stem cell transplantation attenuates cardiac fibrosis associated with isoproterenol-induced global heart failure〔J〕.Transpl Int，2008;21(12):1181-9.

16 Jones WK，Brown M，Ren X，et al.NF-κB as an integrator of diverse signaling pathways:the heart of myocardial signaling〔J〕.Cardiovasc Toxico1，2003;3(3):229-54.

17 Nakashima H，Aoki M，Miyake T，et al.Inhibition of experimental abdominal aortic aneurysm in the rat by use of decoy oligodeoxynucleotides suppressing activity of nuclear factor kappaB and ets transcription factors〔J〕.Circulation，2004;109(1):132-8.

18 Bond M，Chase AJ，Baker AH，et al.Inhibition of transcription factor NF-kappaB reduces matrix metalloproteinase-1，-3 and-9 production by vascular smooth muscle cells〔J〕.Cardiovasc Res，2001;50(3):556-65.