Cyclin E RNA干擾載體的構(gòu)建及其對(duì)EC9706細(xì)胞Cyclin E表達(dá)的影響

王 娜，冷 弘，李 敏，臧文巧 ，王媛媛

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州 450001 2)洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室 洛陽 471000

細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征之一，細(xì)胞增殖受調(diào)控機(jī)制的嚴(yán)密監(jiān)控，不受約束的細(xì)胞增殖將導(dǎo)致細(xì)胞癌變。細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。G1期周期蛋白Cyclin E能夠與CDK2一起促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂。臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)，Cyclin E基因mRNA及蛋白過表達(dá)與癌癥的發(fā)生有一定關(guān)系，提示Cyclin E過表達(dá)是癌變?cè)缙谑录?。RNA干擾技術(shù)可以特異阻斷或降低其靶向基因的表達(dá)，在抑制腫瘤生長的基礎(chǔ)研究[3]方面取得了一定的進(jìn)展。該研究旨在構(gòu)建Cyclin E基因RNA干擾載體，建立其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞系，為深入研究Cyclin E和食管癌發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人食管癌細(xì)胞株EC9706(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保存)；pRNAT-CMV3.1/Neo載體(購自美國GenScript公司)；BamHⅠ、AflⅡ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、新霉素(購自大連寶生物工程有限公司)；質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒(購自北京天澤基因科技有限公司)；小量總RNA提取試劑盒(購自德國Qiagen公司)；熒光定量PCR試劑盒(購自大連寶生物工程有限公司)；鼠抗Cyclin E單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體、鼠抗GAPDH抗體(購自美國Santa Cruz公司)；LipofectamineTM2000 (購自美國 Invitrogen公司)；小量DNA膠回收純化試劑盒(購自廣州東盛生物科技有限公司)。

1.2靶向CyclinE基因siRNA的設(shè)計(jì)、合成、退火利用Dharmacon公司提供的siRNA靶片段分析設(shè)計(jì)在線軟件siDESIGN Center，掃描人Cyclin E mRNA 編碼序列(NM_057182.1)，經(jīng)BLAST同源性分析，確定951～969位和1 122～1 140位為siRNA靶序列，合成2對(duì)編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈(ss1F、ss1R和ss2F、ss2R)，兩端分別加上BamHⅠ和AflⅡ內(nèi)切酶殘基。4條DNA單鏈分別為ss1F 5’-GATCCGCAAAAGGTTTCAGGGTATTTCAAGAGAAT

ACCCTGAAACCTTTTGCTTTTTTC-3’(59 bp),ss1R 5’-TTAAGAAAAAAGCAAAAGGTTTCAGGGTATTCTCTTG

AAATACCCTGAAACCTTTTGCG-3’(59 bp)，ss2F 5’-GATCCGGACAAAGCCCGAGCAAAGTTCAAGAGACTT

TGCTCGGGCTTTGTCCTTTTTTC-3’(59 bp)，ss2R 5’-TTAAGAAAAAAGGACAAAGCCCGAGCAAAGTCTCTT

GAACTTTGCTCGGGCTTTGTCCG-3’(59 bp)。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。去離子水70 μL溶解短發(fā)夾DNA單鏈，退火反應(yīng)體積50 μL，退火體系如下：10×退火B(yǎng)uffer 5 μL，DNA單鏈ss1F、ss1R(或ss2F、ss2R)各22.5 μL。退火反應(yīng)：95 ℃ 6 min，70 ℃ 8 min，緩慢降至30 ℃維持10 min，緩慢降至4 ℃。20 g/L低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，小量DNA膠回收純化試劑盒回收純化。獲得DNA雙鏈ds1、ds2。

1.3siRNA載體質(zhì)粒線性化BamHⅠ和AflⅡ酶切siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo，酶切體系如下：10×緩沖液5 μL，BamHⅠ 2 μL，AflⅡ 2 μL，pRNAT-CMV3.1/Neo 41 μL。37 ℃水浴2 h，70 ℃ 5 min滅活內(nèi)切酶BamHⅠ和AflⅡ。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大片段線性雙黏siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo。

1.4發(fā)卡樣退火產(chǎn)物與siRNA載體的重組T4 DNA連接酶連接ds1、ds2與線性雙黏siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo。連接反應(yīng)：2×Buffer 5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，膠回收退火產(chǎn)物各3 μL，線性雙黏siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo 1 μL。4 ℃過夜連接。獲得重組產(chǎn)物pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1、pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。

1.5重組質(zhì)粒的篩選鑒定從終質(zhì)量濃度50 mg/L氨芐青霉素LB平板上各挑取2個(gè)菌落劃線接種于LB平板上，培養(yǎng)16～18 h，再轉(zhuǎn)種入氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12 h。采用北京天澤基因科技有限公司柱式質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒分別提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞提取純化pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1、pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2和pRNAT-CMV3.1/Neo-Con質(zhì)粒。復(fù)蘇EC9706細(xì)胞，按Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000操作說明轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分4組，干擾1組(轉(zhuǎn)染pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1)、干擾2組(轉(zhuǎn)染pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2)、無關(guān)siRNA對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pRNAT-CMV3.1/Neo-Con)、空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，僅用脂質(zhì)體處理),18 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察，488 nm最大波長激發(fā)。轉(zhuǎn)染12 h后，用含有400 mg/L新霉素和青、鏈霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，3～4周后得到大量穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)檢測和試驗(yàn)。

1.7RT-PCR檢測CyclinEmRNA表達(dá)使用Qiagen公司小量總RNA提取試劑盒提取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用寶生物工程有限公司的熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增，Cyclin E擴(kuò)增引物5’-CGGGTCCACAGGGATGCGAAGGA-3’和5’-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA-3’。內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增引物5’-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3’和5’-CAATGCCAGCCCCAGCGTCA-3’。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性20 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均擴(kuò)增5管，以Cyclin E的表達(dá)量與內(nèi)參GAPDH表達(dá)量的比值作為Cyclin E的相對(duì)表達(dá)量。

1.8Western-blot檢測CyclinE蛋白表達(dá)裂解各組細(xì)胞，用Bradford法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量。SDS-PAGE凝膠100 V，電泳1 h，轉(zhuǎn)膜。置膜于25 mL封閉緩沖液中1 h。1800鼠抗Cyclin E單克隆抗體及鼠抗GAPDH，室溫孵育1～2 h。12 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育1 h，顯色。成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行分析處理, 各組細(xì)胞Cyclin E mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1靶向CyclinE基因siRNA載體構(gòu)建結(jié)果

2.1.1 發(fā)卡樣DNA的退火結(jié)果 ss1F、ss1R、ss2F、ss2R發(fā)卡樣DNA寡核苷酸單鏈，退火形成DNA雙鏈產(chǎn)物ds1和ds2，退火后電泳可見明亮條帶，位于100 bp下接近100 bp處，與設(shè)計(jì)一致，見圖1。

2.1.2 重組載體插入序列測序結(jié)果 從轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)菌中提取載體質(zhì)粒，對(duì)插入序列進(jìn)行測序。將插入序列分別與所設(shè)計(jì)序列進(jìn)行比對(duì)，序列完全相同，無堿基差異，見圖2、圖3?？梢娭亟M載體中插入序列與所設(shè)計(jì)序列一致，發(fā)卡樣雙鏈DNA序列成功重組到siRNA載體上。

2.2轉(zhuǎn)染結(jié)果倒置熒光顯微鏡下觀察，干擾1組、干擾2組、無關(guān)siRNA對(duì)照組可見到有綠色熒光蛋白表達(dá)，細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，隨后逐漸增加，1周

后熒光趨于穩(wěn)定；空白對(duì)照組細(xì)胞則無熒光。見圖4。

圖1 siRNA發(fā)卡樣DNA的退火電泳結(jié)果

1：ss1F、ss1R發(fā)卡樣單鏈DNA退火產(chǎn)物；2：ss2F、ss2R發(fā)卡樣單鏈DNA退火產(chǎn)物；M：Marker。

圖2 pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1插入序列與設(shè)計(jì)序列ss1F比對(duì)結(jié)果

圖3 pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2插入序列與設(shè)計(jì)序列ss2F比對(duì)結(jié)果

2.3RT-PCR檢測各組細(xì)胞CyclinEmRNA表達(dá)結(jié)果各組細(xì)胞Cyclin E mRNA的相對(duì)表達(dá)量見表1。

圖4 倒置熒光顯微鏡下各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞(×200)

2.4免疫印跡結(jié)果干擾1組、干擾2組、空白對(duì)照組、無關(guān)siRNA對(duì)照組細(xì)胞在大約54 000處均有免疫印跡出現(xiàn)，其中空白對(duì)照組和無關(guān)siRNA對(duì)照組的免疫印跡強(qiáng)于干擾1組和干擾2組，見圖5。

表1 各組細(xì)胞Cyclin E mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

F=15.381，P=0.002；*與空白對(duì)照組、無關(guān)siRNA對(duì)照組比較，P均<0.05。

圖5 Western-blot結(jié)果

1：干擾1組；2：干擾2組；3：無關(guān)siRNA對(duì)照組；4：空白對(duì)照組。

3 討論

細(xì)胞的增殖是受到機(jī)體內(nèi)外環(huán)境不同水平嚴(yán)密監(jiān)控的，細(xì)胞增殖失去控制導(dǎo)致異常增殖則形成腫瘤[4]。周期蛋白與其他調(diào)控物質(zhì)共同構(gòu)成了細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。目前已分離的周期蛋白有數(shù)十種，在控制細(xì)胞分裂過程中執(zhí)行多種多樣的功能，保證細(xì)胞周期的正常運(yùn)行。細(xì)胞周期蛋白在腫瘤的發(fā)病機(jī)制、基因治療等基礎(chǔ)研究[5-9]方面取得一定進(jìn)展。

Cyclin E是一種G1期周期蛋白，是細(xì)胞能夠通過細(xì)胞周期限制點(diǎn)“R”的一個(gè)限制因素。Cyclin E通過活化周期蛋白依賴性蛋白激酶2，級(jí)聯(lián)活化其下游一系列蛋白質(zhì)，促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)換[10-11]。在正常細(xì)胞周期中，Cyclin E的消長是受到嚴(yán)密控制的。Cyclin E的過度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞分裂不受控制，引起腫瘤[12-13]。RNA干擾技術(shù)可以特異阻斷或降低其靶向基因的表達(dá)，通過抑制引起腫瘤發(fā)生的重要蛋白的表達(dá)而抑制腫瘤的生長、黏附、侵襲、耐藥等能力[14-16]。研究者[17-19]從不同的角度揭示了Cyclin E基因和癌癥發(fā)生的關(guān)系。

該研究設(shè)計(jì)合成了靶向Cyclin E基因的siRNA，連接入pRNAT-CMV3.1/Neo載體，成功構(gòu)建了靶向Cyclin E基因的RNA干擾載體。轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞CE9706后，干擾1組、干擾2組與空白對(duì)照組和無關(guān)siRNA對(duì)照組比較，Cyclin E mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，Cyclin E蛋白表達(dá)量明顯下降。

試驗(yàn)結(jié)果提示，所構(gòu)建的靶向Cyclin E基因RNA干擾載體在細(xì)胞內(nèi)能有效降低Cyclin E 蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步深入研究所構(gòu)建載體對(duì)食管癌細(xì)胞CE9706增殖、黏附、侵襲能力的影響奠定了基礎(chǔ)。

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