肺癌患者外周血基因組DNA端粒長度的變化及意義*

魏小玲,譚善娟,吳擁軍#

1)鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室 鄭州 450001 2)青島市市立醫院醫院感染管理科 青島 266071

肺癌是一種嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤[1-3]。肺癌的預后取決于早期診斷和有效的治療，尋找肺癌發生發展過程中的早期效應生物學標志成為肺癌研究的焦點。端粒是由非編碼TTAGGG重復和相關的端粒結合蛋白組成的核蛋白復合物，其主要功能是維護染色體的完整性和穩定性，防止染色體的降解和融合[4]。許多研究[5-6]都在探索端?？s短與癌癥危險性的關系，但結果仍有爭議。目前關于端粒長度與肺癌關系的研究尚無定論。Jang等[5]報道外周血基因組DNA端粒縮短可能是肺癌的一個危險因素，但Shen等[6]研究卻發現肺癌患者血液中端粒相比正常對照變長。作者應用熒光定量PCR法測定肺癌患者、正常對照的外周血基因組DNA端粒長度，探討外周血基因組DNA端粒長度與肺癌的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象200例肺癌患者選自2009年1月至2010年5月鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科確診病例,均經病理學或細胞學證實為原發性肺癌，其中鱗狀細胞癌87例，腺癌72例，其他類型41例；Ⅰ+Ⅱ期55例，Ⅲ+Ⅳ期145例。200例正常對照選自鄭州大學第一附屬醫院正常體檢人群，體檢中未發現肺部或其他器官腫瘤。經知情同意后由專業調查員和醫生收集一般資料并采集標本。一般資料包括性別、年齡、吸煙史等，其中吸煙的定義為1支/d且吸煙1 a以上。

1.2外周血基因組DNA的提取抽取研究對象靜脈血3 mL，外周血基因組DNA提取按照上海萊風生物技術公司DNA提取試劑盒說明進行操作。提取的DNA用紫外分光光度計測吸光度(A)值，選取A(260 nm)/A(280 nm)介于1.7～2.0的樣品用于試驗。

1.3相對端粒長度(RTL)的測定采用美國Startagene公司的MX3000P PCR儀，參考實時熒光定量PCR 法[7]進行RTL測定。端粒基因的引物序列Tel1：5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’,Tel2：5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’。內參引物序列GAPDH1：5’-TACTAGCGGTTT TACGGGCG-3’，GAPDH2：5’-GAACAGGAGGAGCA GAGAGCGA-3’。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系：2×SYBY q PCR Master Mix(Promega, 美國)10 μL, 10 mmol/L引物0.5 μL，模板DNA 2 μL。反應條件： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s,61 ℃ 1 min，40個循環。用PCR儀自帶的軟件分析數據。根據陰性對照和基線確定Ct值，并根據溶解曲線確定Ct值的有效性。每個樣品均做3個平行樣并取均值作為該樣品的Ct值，每一輪PCR反應均設一個陰性對照以排除假陽性結果。ΔCt=Ct目的基因-Ct內參，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt內參，以2-ΔΔCt表示RTL。

1.4統計學處理應用SPSS 12.0進行數據分析。2組性別構成、吸煙狀態的比較用χ2檢驗；2組年齡、RTL的比較，不同臨床病理特征患者RTL的比較采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；采用非條件logistic回歸分析RTL與肺癌危險性的關系；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組外周血基因組DNARTL的比較研究對象的一般情況見表1。2組年齡、吸煙狀態構成差異有統計學意義，故分層比較RTL，見表2。

表1 2組研究對象的一般特征

表2 2組外周血基因組DNA RTL的比較

2.2RTL與肺癌危險性的logistic回歸分析按對照組RTL的中位數為分界點，分別將2組分成2層(RTL>0.95和≤0.95，分別賦值0和1),將RTL、年齡、吸煙狀態納入非條件logistic回歸方程，結果見表3。

2.3不同臨床病理特征肺癌患者外周血基因組DNARTL的比較見表4。

表3 非條件logistic回歸分析結果

表4 不同臨床病理特征肺癌患者RTL的比較 例

3 討論

端粒的作用是保護染色體的完整性和穩定性，但極易受外源性理化因素的攻擊。正常體細胞中染色體按照傳統的機制復制造成端粒復制不完全，因末端復制問題導致端粒在每個細胞分裂周期都會縮短50～100 bp，當端?？s短到臨界長度時，細胞就會出現衰老以致死亡[8]。當有外源性理化因素的刺激時，端?？s短會越過臨界點,使染色體損傷，而染色體損傷可能是腫瘤發生過程中一個重要的遺傳學機制。端粒長度變化反映了端粒結構和功能的改變，可作為一項DNA/染色體穩定性改變的早期指標[9-10]。

Han等[11]報道端粒長度與患黑色素瘤的危險性正相關，但與患基底細胞癌風險負相關。Jang等[5]報道外周血基因組DNA端粒縮短可能是患肺癌的一個危險因素。該研究結果表明，肺癌組外周血基因組DNA RTL要短于對照組；非條件logistic回歸分析結果表明，將年齡和吸煙狀態作為混雜因素進行校正后，按對照組的中位數將RTL分成2層，短端?；挤伟┑娘L險是長端粒的3.264倍。Jang等[5]亦認為端?？s短是肺癌的一個危險因素，可以作為肺癌早期的敏感指標。因此，外周血基因組DNA RTL可用于預測患肺癌的風險，且外周血取材方便，適宜隨訪監測。雖然該研究未發現吸煙水平對端粒長度有影響，但有報道[12]顯示端粒長度隨著吸煙劑量的增加出現變短的趨勢。

該研究結果顯示，不同組織學類型和不同臨床分期的肺癌患者外周血基因組DNA的RTL差異無統計學意義，提示端粒長度與肺癌的進展可能無關。

綜上所述，端?？s短可增加患肺癌的危險性，可能是肺癌發生發展過程中的早期效應生物學標志，但其與肺癌的進展可能無關；外周血基因組DNA的RTL檢測可用于肺癌風險的預測。

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