褪黑素對大鼠急性脊髓損傷后不同時期IL-10表達的影響

徐玉生，李星晨，金偉林，馬玉斐，曾冠楠，王培松

鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后大量的炎性細胞浸潤和大量炎癥細胞因子的產生是導致脊髓漸進性潰變的主要因素[1]。有學者[2]報道，SCI后多種細胞因子明顯上調，其參與并調節損傷誘導的炎癥反應在繼發性損傷的病理過程中起著重要作用。研究[2-4]發現白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)可對SCI脊髓組織中NF-κB表達和巨噬細胞浸潤產生影響，從而減輕炎癥反應。實驗[3]證實褪黑素對多種器官損傷后的炎癥反應有抑制作用，但對SCI后神經細胞周圍炎癥反應及修復的作用尚不明確，特別是對細胞因子IL-10的分泌作用至今未闡明。作者通過觀察SCI后一次性注射人褪黑素制劑，觀察脊髓和血液中IL-10的變化，探索褪黑素誘導內源性IL-10的表達對SCI的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康成年雄性SD大鼠108只，體質量(220±20)g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。在通風、適宜溫度和濕度的動物室內常規飼養1周。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學要求。

1.2主要試劑及儀器Trizol試劑、RT試劑盒(編號：AE101-01)和PCR試劑盒(編號：AP111-12)均購自Transgene公司，引物購自北京博大泰克公司，大鼠IL-10 ELISA試劑盒購自美國RD公司，兔抗鼠IL-10抗體、DAB試劑盒和SP9002免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，褪黑素、DEPC和EB購自美國Sigma公司。PCR GeneAmp System(美國Applied Biosystems公司，型號：2700)，低溫離心機(美國Sigma公司，型號：3K30)，圖像記錄分析系統(大連Jim-X Scientific，型號：D-140)，LE ICACM 1900恒冷箱切片機。

1.3動物模型的建立以體積分數10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠取俯臥位，固定于操作臺上。術區備皮，常規消毒鋪巾，取后正中切口，以T12為中心顯露T11～13棘突和椎板，咬除T12節段椎板，暴露脊髓硬膜。硬膜上方放置一圓形塑料墊片(直徑6 mm)，再采用改良的Allen’s WD法，用預實驗中確定的致傷質量(5 g)的砝碼自距硬膜15 cm的高度沿導管垂直落下，造成大鼠SCI模型。造模成功的標準：打擊后鼠尾出現無規則的痙攣性擺動、雙下肢呈回縮性撲動，硬膜表面充血水腫。術畢以生理鹽水沖洗術野，再次消毒后常規縫合切口。

1.4動物的分組及干預采用隨機數字表法將108只大鼠分為SCI組(A組)、褪黑素治療組(B組)和假手術組(C組)。A、B 2組按1.3的方法造模，10 min后分別按體質量腹腔注射等體積的含體積分數5%乙醇的生理鹽水和褪黑素(100 mg/kg)，對照組僅行椎板切除術而不損傷脊髓。各組大鼠每日均給予青霉素40萬U腹腔注射預防感染，A、B 2組術后給予人工輔助排尿、排便4～5次/d。

1.5BBB運動功能評分分別于術后第1、2、3、5、7天將大鼠置于評分操作臺上，環境適應后由3位熟悉評分標準但不知分組者獨立觀察4 min，取平均值作為評分結果。每時間點每組均隨機選取6只大鼠，評分后處死，取血清和脊髓組織備用。

1.6組織固定、取材及切片制備于術后第3天時每組中隨機選取6只大鼠，腹腔注射麻醉后行升主動脈灌注(37 ℃的生理鹽水400 mL充分沖洗組織內血液)，并以4 ℃ 40 g/L的多聚甲醛進行固定，30 min后取出手術部位脊髓標本，放置于40 g/L的多聚甲醛中室溫保存。用LE ICACM 1900恒冷箱切片機對脊髓組織作橫切面切片(6 μm厚)，載玻片收集組織后，恒溫烘箱烘干進行HE染色及免疫組化SP法染色。

1.7血清中IL-10水平檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中IL-10的含量。每例樣本取10 μL血清加入每個孔內，按試劑盒流程說明進行操作，最終于450 nm波長下測定吸光度(A)，根據標準曲線計算樣品中IL-10的含量。

1.8脊髓中IL-10mRNA表達的RT-PCR檢測

稱取100 mg凍存的脊髓組織，提取總RNA。大鼠IL-10上游引物序列5’-CAGTCAGCCAGACCCACAT-3’，下游引物序列5’-GGCAACCCAAGTAACCCT-3’，擴增產物大小為141 bp 。內參GAPDH上游引物序列5’-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3’，下游引物序列5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，擴增產物大小為595 bp。反應體系RT-PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環；72 ℃延伸6 min。取5 μL擴增產物進行電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，記錄圖像后用D-140圖像記錄分析系統進行分析，以目的基因和內參條帶的灰度值的比值表示目的基因的相對表達量。

1.9組織學觀察及IL-10蛋白表達的檢測HE染色觀察脊髓病理改變；免疫組化按 SP9002試劑盒說明書操作，中性樹脂封片。每個標本取同序數切片6張，兔抗鼠IL-10抗體(按200倍稀釋)為一抗。以PBS代替一抗作為陰性對照，細胞核和(或)胞質染成黃褐色或黑色為陽性細胞。每張片計數高表達區3個高倍鏡視野中的陽性細胞個數，最后取算術平均數代表該標本IL-10蛋白的表達水平。

1.10統計學處理采用SPSS 17.0進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組大鼠BBB評分、血清中IL-10水平和脊髓組織中IL-10 mRNA及蛋白表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠的一般情況共108只大鼠，操作過程中A組3只、B組1只因麻醉過深后死亡，A組4只、B組2只造模不成功后踢出實驗，后進行同情況下補充。術后早期：A 、B 2組大鼠活動及進食明顯減少，C組較術前未有明顯改變；A、B 2組均出現后肢癱瘓，尿潴留情況。術后晚期：B、C 2組較A組大鼠活動及進食較好。取脊髓標本見A組損傷部位出現潰瘍及大量的無菌性炎癥反應；B組炎癥反應較輕，未見潰瘍面。

2.2術后各組各個時間點BBB運動功能評分比較

見表1。

表1 術后各組各個時間點BBB運動功能評分比較 (n=6)

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

2.3術后各組各個時間點血清中IL-10含量比較見表2。血清中IL-10水平從高到低依次為B組、A組、C組，且各組間差異有統計學意義(P<0.001)，且A、B組術后第5天達到高峰。

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

2.4術后各組各個時間點脊髓中IL-10mRNA表達水平比較見表3。脊髓中IL-10 mRNA表達水平各個時間點從高到低依次為B組、A組、C組，且各組間差異有統計學意義(P<0.001)，A、B 2組術后在第5天達到高峰。

2.5脊髓標本HE染色和免疫組化染色結果見圖1。A、B 2組出現脊髓組織血管充血，B組較A組神經細胞脫水變化輕，說明褪黑素可以減輕脊髓損傷后病理變化。免疫組化見IL-10在中央管附近的神經細胞及神經膠質細胞胞質中分布較多，其中中央管室管膜細胞胞質中也有較強表達。陽性細胞計數從多到少依次為B組[(10.6±1.8) 個/HP]、A組[(9.1±1.4) 個/HP]和C組[(4.1±0.5) 個/HP]，差異有統計學意義(F=146.281,P<0.001)。各組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01)。

表3 術后各組各個時間點脊髓中IL-10 mRNA表達水平比較 (n=6)

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

圖1 各組大鼠脊髓HE染色和免疫組化染色結果

3 討論

急性脊髓損傷后脊髓組織主要有缺血、脂質過氧化、離子的失衡、炎癥細胞浸潤和炎癥因子的釋放等表現。其中炎癥因子的大量產生和釋放是繼發性損傷的主要過程。有效地控制SCI后的炎癥反應，盡可能地使繼發性損傷的程度降到最低，是改善預后的關鍵所在。

褪黑素是一類主要有松果體細胞分泌的肽類激素，具有調節時間節律、影響神經內分泌、調節體溫中樞等生理作用，并可減輕中性粒細胞介導的毒性損害作用[5]。研究證實其對脊髓的保護作用主要是通過提高神經營養作用[4，6]、減輕炎癥反應[7]、減少細胞凋亡[8]來實現的。作者的前期實驗[6]已經證實100 mg/kg的褪黑素具有提高神經生長因子表達、抑制脂質過氧化反應作用。該實驗結果顯示SCI后100 mg/kg的褪黑素對大鼠食欲和精神狀態的改善較為明顯，可能與其有維持生物正常的晝夜節律、抗疲勞、焦慮、抑郁[9]和鎮痛[10]的作用有關。實驗中觀察到在SCI晚期B組相對于A組未出現嚴重的無菌性炎癥反應和潰瘍面，說明褪黑素對損傷后的脊髓保護作用是顯著的。

IL-10是一種可以抑制Th1細胞合成細胞因子的因子，被稱為細胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)[11]，SCI后其會反應性的顯著增高[7]。Jackson等[12]研究證實IL-10能夠抑制早期炎癥反應，特別是對SCI后細胞中的NF-κB轉錄因子的抑制作用。局部膠質細胞、小膠質細胞、中央管周圍內皮細胞和神經細胞在SCI后激活NF-κB[13]，通過自分泌和旁分泌途徑產生TNF、IL-1、IL-6和IL-8等因子，嚴重影響組織器官的修復[14]。這些細胞也產生抗炎性細胞因子IL-10[15]，并對NF-κB表達有明顯的抑制作用[16]，從而也抑制單核巨噬細胞等炎性細胞的浸潤[11-13]。打破這種平衡并增加抗炎因子分泌成為治療的首要途徑。該實驗結果顯示血清中IL-10的表達量和脊髓中IL-10 mRNA的水平在各個時間點均有B組高于A、C 2組，并且在損傷后第5天出現高峰的現象，證明100 mg/kg的褪黑素能夠影響IL-10的表達，且能夠明顯提高高峰期的表達水平。免疫組化結果也證實了IL-10蛋白表達的部位及細胞主要集中在中央管周圍的室管膜細胞胞質及神經細胞和膠質細胞胞質中。

總之，作者的研究結果可以直接和間接證明褪黑素能通過IL-10起到抗炎與脊髓神經修復的作用。褪黑素對SCI大鼠體內IL-10水平的作用是課題組研究的一個開端，作者對褪黑素的理解仍處在初級階段，其對SCI后的修復作用不僅僅是在一個炎癥因子方面。今后作者還將研究褪黑素對其他的炎癥因子的表達是否有類似的促進作用等。褪黑素有可能成為繼甲強龍后的一個治療急性SCI的有效藥物[17-18]，因此認為褪黑素的應用前景非常廣闊。

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