高效液相色譜法測定枳術寬中膠囊的含量

申國華，行江水

(山西省食品藥品檢驗所，山西太原 030001)

枳術寬中膠囊是由白術(炒)、枳實、柴胡等藥味組成，具有健脾和胃，理氣消痞的功效，用于胃痞(脾虛氣滯)，癥見嘔吐、反胃、納呆、返酸，以及功能性消化不良見以上癥狀者。其中枳實為君藥，作為君藥的枳實具有理氣寬中，行滯消脹的功效;枳實中主要含有黃酮類、生物堿類、揮發油類等成分，但含黃酮類成分(橙皮苷、柚皮苷等)的中藥材比較普遍，代表性及專屬性低，化學性質等方面比較穩定，受采收及放置時間等因素的影響小;而生物堿類成分辛弗林的含量受到不同種類、產地、采收季節及貯存時間的影響。根據這一情況以及《中國藥典》一部中枳實及其他含枳實處方作為含量測定指標［1］。本文將君藥枳實中專屬性強的辛弗林作為質控指標，采用高效液相色譜法進行含量測定［2］，從而控制本品的質量狀況。結果表明本方法專屬性好、重復性好、準確度符合要求、靈敏度高，可用于對本品的質量控制。現報告如下。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀;色譜柱:采用SUNTEK Kromasil C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);Dikma Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純;辛弗林(中國藥品生物制品檢定所 批號:0727－20004供含量測定用)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜柱 方法學考察采用SUNTEK Kromasil C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);Dikma Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，均能滿足分離要求;波長:辛弗林在225 nm、275 nm處有最大吸收，225 nm的吸收值明顯高于275 nm，故選擇225 nm作為測定波長(見圖1)。

圖1 辛弗林紫外掃描圖譜Fig 1 Scanning Atlas of Synephrine Ultraviolet

2.1.2 流動相 以乙腈－十二烷基硫酸鈉溶液為流動相，梯度洗脫(見表1)。

十二烷基硫酸鈉溶液配制(十二烷基硫酸鈉2 g，磷酸1 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL)

表1 梯度洗脫程序 %Table 1 Gradient Elution Programme %

2.1.3 耐用性實驗 儀器改用LC-2010液相色譜儀、waters2695液相色譜儀;色譜柱使用SUNTEK Kromasil C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，資生堂 Dikma Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);均能達分離要求。

2.2 供試品溶液的制備

取重量差異項下的本品混勻，取2 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40 min(功率250 W，頻率33 KHz)，放冷，用甲醇補足減失的重量 ，精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加磷酸溶液(取1.5 mL磷酸，加水200 mL)溶解，分次轉移至25 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得 ，進樣10 μL。

2.3 陰性對照干擾試驗

按處方比例取(除枳實外)全部藥味，按本品工藝及供試品溶液的制備方法制備空白對照溶液，按上述供試品溶液的制備依法進行測定，結果表明:在辛弗林對照品的保留時間處，無其他成分干擾(見圖2～4)。

圖2 辛弗林對照品溶液HPLC圖Fig 2 HPLC Diagram for Reference Suhstance Solution of Synephrine

圖3 供試品溶液HPLC圖Fig 3 HPLC Diagram for Test Solution

圖4 枳實陰性對照HPLC圖Fig 4 HPLC Diagram for Citrus Aurantium Negative Control

2.4 精密度試驗

精密吸取同一份供試品溶液，重復進樣6次，RSD為2.7%，儀器精密度良好(見表2)。

表2 儀器精密度考察Table 2 Inspection of Instrument Precision

2.5 線性關系的考察

稱取辛弗林對照品適量，加甲醇制成0.080 8 mg/mL的對照品溶液，分別精密進樣1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，依法測定，以辛弗林進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，作回歸方程，其回歸方程為Y= －4.154+2 02.5X，r=0.999 9。結果表明，辛弗林在0.080 8～ 1.616 μg范圍內，進樣量與峰面積之間呈良好線性關系，結果見表3。

表3 標準曲線數據列表Table 3 Data List of Standard Curve

2.6 穩定性試驗

取同一份供試品溶液 ，分別在制備后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h后依法測定辛弗林的峰面積 ，結果表明供試品溶液在24 h內基本穩定。見表4。

2.7 重復性試驗

取同一批供試品溶液，依法平行測定6份，分別計算辛弗林的含量，結果表明本實驗方法重復性好。見表5。

2.8 準確度試驗

采用加樣回收方法，精密量取5 mL、4 mL、6 mL辛弗林對照品(濃度為0.178 8 mg/mL)，減壓蒸干溶劑，再加入已知含量的樣品(山西雙人藥業有限責任公司 批號 20100607，含量0.894 mg/g)1.0 g、0.8 g、1.2 g各3份，照“2.2項”下制備9份供試品溶液，依法測定，按“回收率=(測得量－樣品含量)×100%/對照品加入量”式計算結果，見表6。結果表明完全滿足實驗要求。

表4 穩定性試驗Table 4 Test of Stability

表5 重復性試驗 mg/gTable 5 Test of Repeatability mg/g

表6 準確度試驗Table 6 Test of Accuracy

3 討論

3.1 流動相的選擇

先以甲醇－磷酸二氫鉀溶液(取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL)(50∶50)為流動相，但十二烷基磺酸鈉價格貴，需要質量較好的色譜純試劑，否則基線不平。后改用十二烷基硫酸鈉后，只需要分析純試劑就能達到好的效果，基線平穩，主峰與雜峰分離較好，流動相比例為(30∶70)時，主峰28 min出峰，但由于后面還有雜峰，使用梯度既可以將雜質洗出，延長了色譜柱的使用壽命，也提高了色譜柱的使用率，故采用梯度進行洗脫比較合適。

3.2 提取方法考察

a)甲醇直接超聲提取，雜質多，分離不好。b)甲醇超聲提取后蒸干，加水溶解后，過聚酰胺柱(60～90目，3 g，干法裝柱)，結果辛弗林峰面積有損失，回收率低;因枳實中的有效成分辛弗林為一種生物堿，故流動相采用離子對試劑進行有效分離，提取中通過加磷酸除去一部分雜質，結果部分雜質成為沉淀，去掉一部分雜質，有利于色譜的分離。

3.3 提取時間的考察

按“2.2”項方法，分別在超聲提取 30、45、60 min后，依法制備測定辛弗林含量，結果分別為0.894、0.892、0.894 mg/g，說明在超聲提取30 min后樣品已提取比較完全。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

［2］羅朝暉，經 輝.反相離子對高效液相色譜法測定積實中辛弗林的含量［J］.中國藥房，2006，17(19):1503.