《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版三部非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗解讀

吳華偉，郎洪武，陳曉春，高金源，鄧 永

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

《中華人民共和國獸藥典》(二○一○年版三部)(以下簡稱為《中國獸藥典》2010年版三部)已于2010年12月27日由農業(yè)部公告第1521號頒布，并于2011年7月1日起施行。在貫徹執(zhí)行2010年版《中國獸藥典》“外源病毒檢驗法”過程中，非禽源細胞及其制品的外源病毒檢驗一直是困擾各獸用生物制品生產企業(yè)檢驗人員的難點內容，為幫助企業(yè)檢驗人員理解和掌握相關內容，本文結合實際檢驗工作，對非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗法進行了梳理和解讀，為規(guī)范非禽源外源病毒檢驗工作提供了參考。

1 《中國獸藥典》2010年版三部非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗的新變化[1-2]

1.1 明確了外源病毒檢驗時細胞種類的選擇原則

與《中國獸藥典》2005年版三部相比，《中國獸藥典》2010年版三部明確了檢測時應選擇的細胞種類，即每一種樣品應至少接種2種細胞:一種為綠猴腎(Vero)傳代細胞，為所有制品外源病毒必選細胞，另一種為疫苗靶動物的細胞(胚胎細胞或新生動物細胞)或細胞系。在非禽源外源病毒檢驗時一般可采用規(guī)定的2種細胞進行檢驗。但在具體檢驗時，往往都需要采用2種以上的細胞進行檢驗。例如在熒光抗體檢測時需要選擇該病毒最敏感的細胞或細胞系(病毒敏感可能是規(guī)定的2種細胞之外)進行培養(yǎng)，才能保證外源病毒污染檢出的可能性最大。因此，針對某個具體的樣品在檢驗時應選擇幾種細胞，應在《中國獸藥典》2010年版三部規(guī)定的細胞選擇原則基礎上，再依據具體情況靈活掌握。

1.2 明確了應接種檢測樣品的劑量 與《中國獸藥典》2005年版三部相比，《中國獸藥典》2010年版三部明確應接種到選擇的細胞單層或敏感動物的已處理樣品(用特異性血清中和或其他方法)的最少劑量，即至少1.0 mL(疫苗制品至少含10頭份)，增加了檢驗的可操作性。

1.3 明確了樣品接種后細胞的最少培養(yǎng)時間和最少繼代次數(shù) 與《中國獸藥典》2005年版三部相比，《中國獸藥典》2010年版三部明確規(guī)定了樣品接種細胞后總培養(yǎng)時間應不少于14 d，培養(yǎng)期間應至少繼代1次，在滿足總原則的基礎上，規(guī)定了采用不同方法最終檢驗時所用的細胞應培養(yǎng)的最少時間，即熒光抗體檢查法使用的細胞應培養(yǎng)5～7 d，致細胞病變和紅細胞吸附性外源病毒檢驗使用的細胞應至少培養(yǎng)7 d，從而解決了2005年版《中國獸藥典》實施時對該條款理解和執(zhí)行上的偏差。鑒于以上原則和要求，外源病毒檢驗時采用傳代細胞應該是首選，但具體的細胞傳代過程(培養(yǎng)時間、傳代次數(shù))應根據細胞的生長特性而定。

1.4 調整明晰了非禽源外源病毒檢驗三種檢驗方法的層次關系 2010年版《中國獸藥典》三部將2005年版《中國獸藥典》三部中“致細胞病變檢查法和紅細胞吸附性外源病毒檢驗”一項拆分為兩個并列的檢驗項目，保留了熒光抗體檢查法，刪除了“綠猴腎(Vero)傳代細胞檢查法”，而在細胞選擇項中明確了Vero細胞為必選細胞，使得非禽源外源病毒檢驗的層次關系更趨清晰，避免了檢驗項目間的交叉，便于理解和執(zhí)行。

1.5 調整了熒光抗體檢測法每種細胞應選擇的熒光抗體類別 與《中國獸藥典》2005年版三部相比，《中國獸藥典》2010年版三部規(guī)定牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)為所有細胞及其制品均應檢驗的病毒，犬源細胞增加了犬細小病毒(CPV)的檢驗，豬源細胞刪除了偽狂犬病毒(PRV)的檢驗，原因為PRV具有泛嗜性，能在多種組織細胞內繁殖并產生明顯細胞病變，特別在豬腎細胞及其細胞系上很敏感，可通過致細胞病變檢查法檢出，減少了檢驗的重復。

1.6 調整了紅細胞吸附性外源病毒檢驗中所使用紅細胞的類別 與2005年版《中國獸藥典》相比，2010年版《中國獸藥典》中紅細胞吸附外源病毒檢驗用紅細胞的數(shù)量由原來的3種減少為2種，刪除了人“O”型紅細胞成分，保留了豚鼠紅細胞和雞紅細胞。

2 《中國獸藥典》2010年版三部非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗關鍵點解析

2.1 樣品處理 待檢樣品必須以適當方法進行處理，可以分為四種情況:(1)對毒種或活疫苗進行檢驗時，樣品應取2～3瓶混合后，用特異性抗血清進行中和(特異性血清使用前應經滅活處理);(2)對細胞進行檢驗時，應進行3次凍融(-70℃)處理;(3)如果特異性抗血清不能完全中和病毒樣品，可采用效價更高的抗血清重做，也可以將樣品接種使用對象動物，接種劑量應滿足1.2項要求，然后采用測特定病毒的抗體(中和試驗、ELISA等)或抗原(PCR、FA或IFA等)的方法進行結果判定;(4)如待檢樣品不感染選用的細胞或不使選用的細胞產生細胞病變且不引起紅細胞吸附時，可不用血清中和。

2.2 細胞的選擇 應符合1.1項。非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗法選用的細胞列表見表1。

表1 不同非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗法選用的細胞

2.3 疫苗接種與培養(yǎng) 應符合1.2、1.3項和2.1項。在進行細胞傳代時，應將上一代細胞培養(yǎng)物-70℃凍融三次，然后1000 g離心10 min，取上清液接種新的相應細胞單層(剩余的上清液應置-70℃保存)，每次繼代均應設立正常細胞對照。最后一次繼代的細胞單層數(shù)量、面積和培養(yǎng)時間應符合熒光抗體檢查法、致細胞病變檢查法和紅細胞吸附性外源病毒檢驗的要求。

2.4 檢查方法

2.4.1 熒光抗體檢查法 熒光抗體檢查法為檢測特定病毒的方法，應選擇該病毒的最敏感細胞進行病毒增殖和檢測，同時設立病毒陽性對照和細胞對照。通常用80%的冷丙酮進行細胞固定，可選擇直接免疫熒光或間接免疫熒光檢查法進行檢測。結果判定:當陽性對照出現(xiàn)特異性熒光，細胞對照無熒光時，如果被檢樣品出現(xiàn)熒光，判為不合格。如果陽性對照組熒光不明顯，或者正常細胞出現(xiàn)熒光，判為無結果，應重檢。2010年版《中國獸藥典》采用熒光抗體檢查法所要求檢測的外源性病毒的敏感細胞和陽性對照參考毒株見表2。

表2 熒光抗體檢查法選擇的細胞及陽性對照參考毒株

2.4.2 致細胞病變檢查法[3]選用細胞見表1，應設立細胞對照。通常用姬姆薩染色來檢驗外源病毒引起的細胞病變，該方法可對DNA和RNA核蛋白進行鑒別染色，其中DNA核蛋白為紫紅色，而RNA核蛋白染為藍色。用顯微鏡檢查單層細胞，觀察包涵體、巨細胞數(shù)量異常和其他由病毒引起的細胞病變是否存在。接種的單層細胞與細胞對照相比較，如發(fā)現(xiàn)外源性病毒引起的特異性病變，判為不合格。

2.4.3 紅細胞吸附性外源病毒檢驗[3]選用細胞見表1，應設細胞對照。通常用其第二代的單層細胞來做，常在25 cm2塑料瓶中培養(yǎng)，檢測時可向每一細胞培養(yǎng)瓶中加入5 mL 0.2%的豚鼠紅細胞和雞紅細胞的等量混合物，將培養(yǎng)瓶同時在2～8℃和20～25℃ 放置30 min，然后用無鈣鎂離子的PBS(可防止大部分非特異性吸附現(xiàn)象)洗滌2～3次，可用肉眼(如利用照明手套式無菌箱)或30～60倍顯微鏡檢查吸附情況。如發(fā)現(xiàn)外源性病毒引起的特異性紅細胞吸附，則判為不合格。常見的能產生血凝現(xiàn)象的動物病毒及紅細胞見表3。

表3 產生血凝現(xiàn)象的常見動物病毒及紅細胞[4]

3 討論與建議

3.1 非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗時的細胞選擇 適宜的細胞選擇是檢出可能污染的外源病毒的基礎。OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)、歐洲藥典、美國獸用生物制品質量標準(1994)等均將基礎種子細胞和毒種外源病毒檢驗時需要使用的檢驗細胞種類作了明確規(guī)定[3，5-7]，而在 2010 年版及之前的《中國獸藥典》中毒種、細胞與其制品的外源病毒檢驗時規(guī)定的需要選擇的細胞相同，在實際操作中可能存在一定的缺陷和不足。按照《中國獸藥典》2010年版三部現(xiàn)行規(guī)定，對毒種和待檢細胞進行外源病毒檢測時，僅選擇Vero和疫苗靶動物來源的兩類細胞，不能全面地檢出潛在的其他病原。如對細胞的外源病毒檢驗而言，可能因為沒有選擇來自細胞來源動物的其他細胞，可能無法檢出來自細胞來源動物的一些外源病毒污染;對種毒而言，若毒種采用非使用對象動物細胞培養(yǎng)，可能無法檢出來自毒種增殖所用細胞來源動物的一些病原。因此，建議在2015年版《中國獸藥典》編纂時，應明確并完善對毒種、細胞以及細胞制品進行外源病毒檢驗時應當選擇哪些細胞的詳細規(guī)定(針對非特定病毒的檢測部分)，并同時修訂附錄36“生產用細胞標準”的“外源病毒檢驗”相關內容。也可考慮將中華人民共和國農業(yè)部683號公告中“生產用細胞系”和“基礎種毒”的外源病毒檢測相關規(guī)定在《中國獸藥典》附錄中獨立成章，規(guī)定其他細胞和毒種的外源病毒檢驗參照基礎細胞和基礎種毒的外源病毒檢測執(zhí)行，而將現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄中的“外源病毒檢驗”限定在成品檢驗使用，從而可切實提高疫苗生產企業(yè)或科研機構應對基礎細胞和基礎種毒的外源病毒檢驗力度，轉變目前我國“重成品檢驗，輕基礎細胞和種毒檢驗”的不良傾向。

3.2 個別特殊產品的外源病毒檢測 《中國獸藥典》2010年版三部中主要有三類特殊產品的外源病毒檢測容易引起檢驗人員的困惑。一是采用禽源材料制備的非禽用活疫苗(如偽狂犬活疫苗)該按禽源還是非禽源外源病毒檢驗方法進行檢驗的問題?？紤]到中華人民共和國農業(yè)部683號公告《獸用生物制品生產用細胞系試驗指導原則》中已規(guī)定了基礎種毒和基礎細胞的系統(tǒng)鑒定方法，因成品使用對象為豬、牛和綿羊，建議該產品外源病毒檢驗可按非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗方法執(zhí)行。二是采用非禽源非靶動物細胞生產的非禽用活疫苗，如狂犬活疫苗(Vero細胞)、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(Marc-145細胞)等。此類產品在進行外源病毒檢測時，建議參考文獻[3]的細胞選擇原則，除《中國獸藥典》2010年版三部中規(guī)定的細胞外，增加制造產品用的動物傳代或原代細胞。以豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗為例，外源病毒檢測時，除選用Vero、MDBK或牛睪丸細胞(用于熒光檢查法檢測BVDV)、ST或PK15外，還應增加Marc-145進行致細胞病變檢查和紅細胞吸附性外源病毒檢查。三是產品質量標準中已采用其他方法作為非禽源外源病毒檢測。此類產品如研發(fā)單位在產品申報注冊時，采用其他方法進行外源病毒檢測，并經農業(yè)部獸藥評審委員會評定、認可的，仍可作為該產品認可的外源病毒檢測方法。例如，豬偽狂犬病活疫苗(HB-98株)除采用《中國獸藥典》中規(guī)定方法外，還增加了PCR方法對鄂A野毒的檢測，水貂犬瘟熱活疫苗中外源病毒檢測采用了雞胚接種試驗和水貂接種試驗等。針對以上情況，建議在《中國獸藥典》2015年版三部編纂時，有必要在“外源病毒檢驗”相關內容中增加對此類特殊產品如何進行外源病毒檢驗的具體規(guī)定，以增加新版《中國獸藥典》的可操作性。

3.3 熒光抗體檢查法的改進建議 熒光抗體檢查法是非禽源外源病毒檢驗中的一種檢測特定病毒的方法。2010年版《中國獸藥典》規(guī)定了所有非禽源細胞及其活疫苗除均應檢測BVDV之外，還規(guī)定了各類細胞應檢測的特定病毒種類:即豬源細胞2種(PPV和 CSFV);牛、綿羊和山羊細胞 1種(BTV);犬源細胞2種(RV和CPV)以及馬源細胞1種(EIAV)。這些需熒光抗體檢測法進行檢測的特定必檢病毒的確定是基于國內動物疫病流行狀況、相關生物制品外源病毒檢測的實際情況以及國內相關診斷試劑的供應情況所作的科學的判斷，基本符合中國現(xiàn)階段非禽源活疫苗外源病毒檢測的實際。但隨著我國動物疫病流行性情況的變化，如豬圓環(huán)病毒病、豬流行性腹瀉、豬繁殖與呼吸綜合征、豬腺病毒病等的發(fā)生，建議2015年版《中國獸藥典》三部編纂時應當考慮這些情況，有必要將豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒等逐步納入外源病毒檢測范圍。此外，為進一步提高熒光抗體檢查法的可操作性，建議可參考國外有關經驗，針對每種細胞及其制品不應檢出的特定病毒，可明確規(guī)定其應接種的具體敏感細胞及做陽性對照時應選用的參考病毒毒株。如美國獸用生物制品中心發(fā)布的《減毒活疫苗中外源性牛病毒性腹瀉病毒的補充檢測方法》就明確規(guī)定，在用熒光抗體檢測法進行外源性BVDV檢測時，應選擇的敏感細胞為牛鼻甲(BT)次代細胞或其他許可的細胞，應選擇的陽性對照病毒有4種:即非致細胞病變型BVDV 1型毒株(New York-1株)、非致細胞病變2型毒株(890株)、致細胞病変BVDV 1型毒株(Singer株)以及致細胞病變BVDV 2型毒株(125株)。

3.4 紅細胞吸附性外源病毒檢驗中使用的紅細胞種類 紅細胞吸附性病毒的檢測是利用某些病毒感染細胞后，能在細胞表面產生能與動物血紅細胞吸附的物質，在一定溫度及適宜的pH條件下，與動物血紅細胞吸附，從而檢查是否有外源性病毒的存在。不同的病毒，甚至同種病毒的不同毒株，能結合的血紅細胞種類、結合時需要的溫度和pH不完全相同。有的紅細胞能被多種病毒吸附，如雞、豚鼠等，許多病毒也能吸附多種細胞(表3)?！吨袊F藥典》2010年版三部規(guī)定在進行紅細胞吸附性外源病毒檢驗時使用的雞紅細胞和豚鼠紅細胞的混合體，基本可以檢測出絕大部分常見的紅細胞吸附性動物病毒，但對于呼腸孤病毒、杯狀病毒(兔出血癥病毒)等對人紅細胞更敏感的紅細胞吸附性病毒而言，漏檢的可能較大。因此，在紅細胞吸附性外源病毒檢驗中，應根據不同的病毒，選用相應的動物紅細胞，若選用多種紅細胞，則檢測陰性結果的可靠性將增加，放置多個溫度進行檢查，也能增加檢測的可靠性。建議在《中國獸藥典》2015年版三部編纂時應當考慮這些特殊情況，鑒于在實際檢驗過程中購買人的O型紅細胞困難及可能存在的生物安全隱患，可考慮通過建立檢測這些特殊病毒的特定方法，以彌補紅細胞吸附性病毒檢測時可能漏檢的情況，增加檢測結果的可靠性和準確性。

3.5 外源病毒檢測用試劑問題 單特異抗血清以及敏感、特異的熒光抗體檢測試劑是外源病毒檢驗的重要物質基礎。與國外先進國家相比，目前我國提供的非禽源標準抗血清和診斷用試劑種類還比較少，質量參差不齊，且獸用生物制品行業(yè)使用的抗血清大都是多克隆抗體，單克隆抗體較少。這些日益成為制約我國獸用生物制品行業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展的瓶頸，應進一步加大我國獸用標準物質研制工作，同時積極拓展渠道加大引進力度，盡快解決困擾獸用生物制品行業(yè)的基礎性物質短缺問題。建議可由國家獸藥監(jiān)管部門牽頭，整合國內診斷試劑研制和生產單位現(xiàn)有資源，以建立我國獸用生物制品檢測用單克隆抗體試劑庫為切入點，指定生產單位定點生產，由中監(jiān)所統(tǒng)一鑒定并對外供應，實現(xiàn)資源和利益共享，并逐步建立和完善其他檢測用標準物質的生產-供應新模式。

3.6 分子生物學等新型檢測方法在外源病毒檢測中的應用 目前，OIE以及美國、歐盟等發(fā)達國家尚未將PCR等分子生物學方法確定為法定的外源病毒檢測方法。但在國際貿易指定試驗或各國的農業(yè)國家標準中，PCR已作為一種快速、靈敏、便宜的診斷方法被廣泛使用，特別是在取代傳統(tǒng)方法不易或不能培養(yǎng)或檢測的病原體的檢測方面具有重要的意義。如OIE已將檢測藍舌病病毒(BTV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)等病毒的PCR方法列為國際貿易指定試驗方法[3]，我國已將檢測豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等病毒的PCR方法列為國家標準。目前，我國部分獸用生物制品在外源病毒檢測及其他項目檢測方面已經開始使用PCR等方法。因此，《中國獸藥典》作為我國獸藥行業(yè)的最高技術法典，不管是從與國際接軌的角度，還是從提升我國獸用生物制品行業(yè)整體檢測水平的角度，都有必要考慮盡早引入分子生物學等新型檢測方法，特別是針對目前尚缺或質量不理想的檢測試劑，如BTV熒光抗體。當然，在確定相應的PCR方法時，可優(yōu)先考慮OIE指定的方法或國家標準，并做必要的驗證，同時加強對相關試劑定點生產企業(yè)的質量管理和監(jiān)督。

致謝:感謝中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測室李慧姣、李俊平以及其他同志在本文撰寫過程中給予的指導和幫助。

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2010年三部[S].

[2]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2005年三部[S].

[3]世界動物衛(wèi)生組織.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)第五版[S].

[4]殷 震，劉景華.動物病毒學[M].第二版.北京:科學出版社，1997:344.

[5]中國人民共和國農業(yè)部公告第683號.獸用生物制品菌(毒、蟲)種種子批建立試驗技術指導原則[S].

[6]張萬清，蔣厚生(譯).美國獸用生物制品質量標準[M].北京:中國農業(yè)科技出版社，1995.

[7]European Pharmacopoeia Commission.European pharmacopoeia 6.0[S].