Poly(I:C)影響間充質干細胞的成骨分化及其對樹突狀細胞的作用①

趙曉寅 劉 丹 劉 柳 侯亞義 (南京大學醫學院免疫與生殖生物學實驗室，南京210093)

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，能夠分化形成脂肪、骨和軟骨等組織，除了具備多向分化潛能，MSC還具有低免疫原性和免疫調節能力[1]。同時，取材的廣泛方便、體外擴增操作的簡單迅速及其可塑性使得MSC在臨床治療中有廣闊的應用前景。作為臨床應用的希望，MSC治療的相關研究已經在許多不同的疾病動物模型中展開，包括異體免疫排斥、器官和干細胞移植、自身免疫和腫瘤免疫等。

免疫細胞外源性和內源性表達的Toll樣受體(TLR)對其在天然免疫和獲得性免疫中抵抗入侵者起到十分關鍵的作用[2，3]。到目前為止，在哺乳動物中發現并確認的TLR有13個(人類10個和小鼠13個)。TLR能夠識別細菌、病毒、真菌等多種病原相關分子模式及某些由宿主產生的分子[4]。TLR能夠被他們特異的配體或激動劑活化，從而引起MyD88依賴的或TRIF依賴的下游信號分子的激活。這些信號通路的激活觸發了下游各種細胞因子、趨化因子和其他炎癥介質的分泌[5]。

近年來的研究發現，骨髓、脂肪和臍帶來源的MSC都能夠表達TLR，TLR信號的活化對MSC的分化、增殖和免疫調節功能的影響依然存在爭議[6-15]。因此，本研究分析了TLR3配體——Poly(I:C)對臍帶MSC表型、細胞增殖、凋亡、成骨分化以及免疫調節功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 臍帶取自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院婦產科，正常足月妊娠剖宮產胎兒的臍帶。所用材料均嚴格遵守醫學倫理道德，經產婦及家屬認可，并經醫院醫學倫理委員會批準。DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基和優級胎牛血清(Gibco公司);膠原酶 Ⅱ、中性蛋白酶和透明質酸酶(Sigma公司);小鼠抗人 PE-CD117、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD31、FITC-CD45和APC-CD105單克隆抗體(ebioscience公司);rmGM-CSF、rmIL-4(Miltenyi Biotec 公司);兔抗小鼠 PE-CD11c、Alexa Flour-CD11c、FITC-CD80、FITC-CD86和APC-MHC-Ⅱ單克隆抗體(ebioscience公司)。

1.2 人臍帶來源間充質干細胞的分離培養 MSC分離及純化按本實驗室常規方法。從手術室取足月剖腹產的胎兒臍帶，在無菌狀態下用預冷的含0.01%青霉素和鏈霉素的PBS沖洗，去掉臍帶內血塊。在DMEM/F12基本培養基中，將臍動脈剝除，其余部分剪成2 mm3碎塊，加入250 U/ml的膠原酶Ⅱ，100 U/ml中性蛋白酶，10 U/ml透明質酸酶，37℃振蕩消化3小時至組織基本消化完全，離心去上清，洗3次，培養于DMEM/F12完全培養基中(含10%FBS)。調整細胞密度為1×109L-1于培養箱中培養(37℃恒溫，5%CO2)，3～4天后，輕輕晃動培養板，全量換液，待細胞豐度達80%左右時，用2.5 g/L的胰酶消化、傳代。取第3～8代細胞，分析其表面標志，確定其為MSC后用于后續試驗。

1.3 小鼠骨髓來源樹突狀細胞的分離與培養 4～6周的C57BL/6小鼠購自揚州大學比較動物中心，所有的小鼠適應環境1周后進行實驗。DC細胞來源于小鼠的骨髓。將C57BL/6小鼠斷頸處死，在無菌條件下取出脛骨和腓骨，置于無菌PBS中待用;使用注射器吸取PBS，反復沖洗骨髓腔，直至骨發白;將骨髓懸液用100目篩網過濾并收集到離心管中。4℃，1 200 r/min離心5分鐘，棄上清，加入紅細胞裂解液，靜置2分鐘后加入 PBS稀釋，4℃，1 200 r/min離心5分鐘，棄上清，加入 PBS混勻，4℃，1200 r/min離心5分鐘后，收集沉淀的骨髓細胞。將收集的小鼠骨髓細胞重懸，調整細胞密度為1×106cells/ml，接種于12孔板中，每孔加入1 ml RPMI1640完全培養基(添加10%FCS胎牛血清，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素，10 ng/ml的GM-CSF，1 ng/ml IL-4)。所有細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下貼壁培養;第三天、第五天半量換液，移除不貼壁的細胞;培養至第六天，通過流式細胞儀鑒定，＞90%的細胞均為CD11c陽性。

1.4 流式細胞儀檢測表面標志

1.4.1 MSC表面標志的檢測 胰酶消化細胞，PBS洗兩遍，4℃，1 200 r/min，離心5分鐘，棄上清;調整細胞密度約每管(1～5)×105個細胞。共三例臍帶MSC，每個標記設三復孔，按照抗體說明書的用量加入同型對照和相應抗體，4℃避光孵育30分鐘，PBS洗三次后，4℃，1 200 r/min，離心5分鐘;用300 μl的PBS充分重懸細胞，最后在流式細胞儀上進行檢測分析。MSC 檢測標志為:CD117、CD29、CD31、CD44、CD105及CD45。

1.4.2 DC表面共刺激分子的檢測 將骨髓單核細胞(5×105cells/孔)與MSC(5×104cells/孔) 于RPMI1640中(添加10%FCS胎牛血清，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素，1 ng/ml IL-4，10 ng/ml GM-CSF)共培養6天，這時單核細胞誘導分化為未成熟的DC。向共培養體系中加入10 μg/ml的Poly(I:C)刺激24小時。由于MSC具有很強的貼壁性，而DC為半貼壁細胞，根據DC與MSC不同的貼壁特性，將DC于共培養體系中輕輕吹下回收，流式細胞儀檢測了DC細胞表面CD86、CD40和MHCⅡ的表達情況。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 CCK-8法是一種基于 WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽]的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測方法。將3～10代的MSC以104cells/孔的密度接種于48孔板中，細胞培養于DMEM/F12培養基中(含10%的FBS，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素)。分別加入1、10、25 和50 μg/ml的 Poly(I:C)處理24小時和48小時，CCK-8檢測細胞增殖。

1.6 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 壞死細胞的Annexin V和PI呈雙陽性，而凋亡細胞為Annexin V陽性，PI陰性，未凋亡細胞Annexin V和PI皆呈陰性。操作步驟:分別加入 1、10、25和50 μg/ml的Poly(I:C)處理MSC 24小時和48小時后，用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞于流式管中;PBS洗兩遍，200 μl binding buffer復懸(約細胞 106個/ml)，加入 2.5 μl Annexin V-FITC;混勻，室溫避光作用10分鐘;加入10 μl 25 μg/ml的PI，避光作用10分鐘;流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 流式細胞術檢測DC吞噬能力 將處理后的DC輕輕吹下培養于24孔板中，加入0.2 mg/ml的FITC-dextran(右旋糖酐)，于 37℃，5%CO2培養箱內孵育60分鐘，另設4℃孵育作為對照。PBS洗3次后，每管加入300 μl的1.2 mg/ml臺盼藍重懸細胞，以淬滅胞外熒光。流式細胞儀檢測FITC-dextran陽性細胞百分比。

1.8 混合淋巴細胞反應

1.8.1 小鼠淋巴結T細胞的獲取 將BALB/c小鼠斷頸處死，無菌條件下取腋下及腸系膜淋巴結置于預冷無菌的RPMI1640培養基中，除去多余的脂肪組織;用注射器針芯將淋巴結細胞輕輕擠出;加入5 ml培養基，反復吹打至細胞懸液均勻后，篩網過濾，收集細胞懸液，離心，棄上清，培養基洗一遍后，計數待用。

1.8.2 混合淋巴細胞反應 DC分為Control組、Poly(I:C)刺激組、MSC共培養+Poly(I:C)刺激組

(MSC∶DC=1∶10或1∶20)。將T細胞用 CFSE 標記后鋪于96孔板中，調整細胞濃度為5×106ml-1，每孔加入100 μl T細胞后，各處理組的DC與T細胞按1∶10的比例加入培養體系中，終體積為200 μl/孔，每組設4個復孔。置于37℃，5%CO2培養箱內培養三天后，流式檢測T細胞增殖情況。

1.9 茜素紅S染色 茜素紅染色的原理是基于沉積的鈣可以與茜素紅發生顯色反應并在細胞外基質中被染成橘紅色。將培養板用PBS洗2次，95%的乙醇固定10分鐘，雙蒸水沖洗3次;0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)37℃染色30分鐘;蒸餾水沖洗后顯微鏡下觀察。

1.10 Q-PCR檢測mRNA表達 用Trizol試劑提取MSC中總的RNA，檢測RNA濃度及純度后，進行反轉錄。反轉錄體系(20 μl):1 μg RNA，4 μl 5 × RT buffer，2 μl dNTP，0.5 μl RNase inhibitor，0.5 μl Oligo dT，0.5 μl ReverTra Ace，加 DEPC 水至 20 μl;反應程序:42℃ 20分鐘，99℃ 5分鐘，4℃ 5分鐘。反轉錄后得到的cDNA進行隨后的Q-PCR。Q-PCR反應體系(10 μl)為:1 μl cDNA(反轉錄產物按1∶10稀釋)，0.5 μl上游引物，0.5 μl下游引物，5 μl 2 ×TransStart SYBR Green QPCR Supermix，3 μl ddH2O。Q-PCR反應程序:95℃ 10分鐘;95℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒(40個循環，72℃收集信號);95℃ 15秒，60℃ 30秒，95℃ 15秒(1個循環，熔解曲線)。反應在ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀中進行，得到各個基因的Ct值，使用2-ΔΔCt方法分析目的基因表達，以GAPDH作為內參。每實驗組設置3個重復，每個樣本設置三個復孔。所用基因的引物由Invitrogen合成，引物序列如表1。

1.11 統計學分析 所有實驗數據均重復三次以上，結果以±s表示，使用 Prism 5(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)對實驗數據進行統計學分析并作圖。One-way ANOVA analysis用來分析3組及以上數據的差異。P＜0.05時，差異具有顯著性。

表1 mRNA上下游引物序列Tab.1 The primer sequences used in PCR

2 結果

2.1 Poly(I:C)不改變MSC的表型 取第3～8代的MSC，以105個/孔的密度接種于6孔板中，Poly(I:C)刺激48小時后，流式細胞儀檢測Poly(I:C)的刺激對MSC表型的影響。結果顯示，Poly(I:C)處理的MSC對CD29、CD44(纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質細胞表達)和CD105(即SH-2)表達呈陽性，CD31(內皮細胞標志)、CD45(造血細胞標志)和CD117(多能造血干細胞標志)的表達呈陰性，與對照組MSC相同，Poly(I:C)不會影響MSC的表型(圖1)。經3代以上傳代后，細胞成分均一，純度在95%以上。

2.2 Poly(I:C)影響MSC的增殖和凋亡 將MSC以2×104個/孔鋪于48孔板中，分別用1、10、25和50 μg/ml的 Poly(I:C)刺激 MSC 24或48小時，CCK-8檢測對MSC細胞增殖的影響，結果發現，1～50 μg/ml的 Poly(I:C)處理 MSC 24和 48小時，OD450的值均不發生改變，TLR3的活化不會影響細胞的增殖(圖2A)。隨后，我們用Annexin-V/PI雙染法檢測不同濃度Poly(I:C)的刺激對MSC細胞凋亡的影響，結果發現，低濃度的Poly(I:C)刺激對MSC沒有影響，而Poly(I:C)濃度達到25 μg/ml后會引起MSC的凋亡(圖2B)。

圖1 人臍帶MSC的表面標志Fig.1 The surface marker of human umbilical cord MSC

2.3 Poly(I:C)抑制MSC的成骨分化 MSC具有成骨分化的能力，我們用1 μg/ml和10 μg/ml Poly(I:C)處理MSC共21天，檢測了Poly(I:C)的刺激對MSC成骨分化的影響。茜素紅染色結果顯示，MSC成骨誘導時加入Poly(I:C)刺激，與對照組相比，成骨效率明顯降低(圖3A、B)。通過 Q-PCR檢測成骨標志基因，可見Runt相關轉錄因子2(Runtrelated transcription factor 2，RUNX2)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣蛋白(Osteocalcin，OC)的表達均明顯降低(P ＜0.05)，圖3C，與染色結果相符。

2.4 MSC抑制Poly(I:C)引起的DC的成熟和功能

將MSC與骨髓單核細胞于RPMI1640完全培養基(添加10%FCS胎牛血清，100 μg/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素，10 ng/ml的 GM-CSF，1 ng/ml IL-4)中共培養7天，單核細胞被誘導成未成熟DC，加入Poly(I:C)刺激24小時。流式細胞儀檢測CD11c陽性的DC對MHCⅡ、CD40和CD86的表達情況。結果顯示，MSC共培養組的DC對表面細胞標志CD40、CD86和MHCⅡ的表達與單獨Poly(I:C)刺激組的DC相比顯著降低(P＜0.05)(圖4A、B)。結果說明，在Poly(I:C)的刺激下，MSC能夠抑制DC成熟表面標志的表達。

圖2 Poly(I:C)對MSC的增殖和凋亡的影響Fig.2 The proliferation and apoptosis of MSC after treated with Poly(I:C)

圖3 Poly(I:C)對MSC成骨分化的影響Fig.3 The Osteogenic differentiation of MSC after treated with Poly(I:C)

圖4 MSC能夠抑制Poly(I:C)引起的DC的成熟和功能Fig.4 MSC can inhibit the maturation and activation of DC with the treatment of Poly (I:C)

未成熟DC具有很強的吞噬功能，隨后我們檢測了Poly(I:C)刺激下MSC對DC吞噬功能的影響。結果顯示，MSC與DC共培養組，DC的吞噬功能比單獨Poly(I:C)刺激組明顯的增強(圖4C)，說明MSC能夠抑制DC的成熟，使其處于未成熟狀態。成熟的DC能夠將抗原遞呈給T細胞，并使其活化，促進T細胞的增殖。我們首先用CFSE標記T細胞，然后將各個處理組[即Poly(I:C)刺激MSCDC共培養組、單獨Poly(I:C)刺激DC組、未刺激DC組]的DC與T細胞按1∶10的比例共培養，3天后流式檢測T細胞的增殖情況。結果顯示，單獨Poly(I:C)刺激組DC能夠顯著的促進T細胞的增殖，而MSC顯著抑制DC細胞的抗原遞呈功能(圖4D)。以上結果說明，在Poly(I:C)刺激下，MSC能夠抑制DC的成熟和功能。

3 討論

MSC具有自我復制、多向分化潛能、造血支持、促進干細胞植入、低免疫原性和免疫調控等特性[16]。近年來的研究發現，骨髓、脂肪和臍帶來源的MSC都能夠表達有活性的TLRs[6-12]。

有研究表明TLRs的活化能夠對MSC的分化和增殖產生影響[13-15]。Hwa 等[17]的研究發現，用TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6 和 TLR-9的配體刺激人脂肪來源的MSC，只有TLR9活化能夠促進MSC的增殖。LPS和PGN能夠促進MSC的成骨分化，CpG則能夠抑制成骨，另外，Poly(I:C)不影響MSC的成骨或成脂分化。Liotta等[6]的研究則認為TLR的活化不影響人骨髓來源MSC的成骨、成脂和成軟骨。Lombardo等[10]的研究則認為，TLR3和TLR4配體刺激能夠促進脂肪來源MSC的成骨分化，但是不影響成脂分化，也不影響細胞增殖。Raicevic等[18]的研究發現，TLR3和 TLR4配體的刺激能夠促進骨髓和脂肪來源MSC的成骨分化，而對臍帶MSC沒有影響。我們的研究發現，在Poly(I:C)的刺激下，人臍帶來源MSC的表型和增殖不發生改變，但是高濃度的Poly(I:C)會引起MSC的凋亡;茜素紅染色結果顯示，Poly(I:C)能夠抑制MSC的成骨分化，同樣成骨相關基因RUNX2、ALP和OC的表達也明顯受到抑制。

關于TLR對MSC免疫調節功能產生何種影響仍不清楚。Liotta等[6]的研究發現TLR3、TLR4的活化會阻斷人骨髓來源BMSC對T細胞的抑制作用。與此相反，Waterman等[14]的研究則認為Poly(I:C)對MSC短時間的活化可以長時間的使其處于免疫抑制功能增強的狀態，對IDO和PGE2的表達增強，對T細胞增殖的抑制作用增強，而TLR4的活化則使MSC更傾向于成為一種炎性MSC。Opitz等[7]的研究發現TLR3和TLR4的活化能夠促進MSC產生IDO，從而促進對T細胞的抑制作用，增強MSC的免疫抑制功能。這些矛盾的結果可能與實驗設計有關。我們將MSC與DC細胞共培養，加入TLR3配體Poly(I:C)的刺激，結果發現，Poly(I:C)存在的情況下MSC能夠抑制DC的活化，增加DC的吞噬功能，使DC趨向于未成熟狀態。

本實驗探討了Poly(I:C)對人臍帶來源間充質干細胞生長、分化和功能的影響，發現了在TLR3配體存在的情況下，MSC依然具有很強的免疫調節功能，并且Poly(I:C)的刺激能夠顯著的抑制臍帶MSC的成骨分化。臍帶MSC取材方便且生長速度快，易于體外大量擴增，具有很高的臨床應用前景。我們關于TLR3對MSC影響的研究為探索炎癥環境對MSC影響的機制以及臍帶MSC的體外應用奠定了基礎。

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