吲哚胺2，3雙加氧酶促進血管形成的體外實驗研究①

魏麗娟 于津浦 賈志龍 李 慧 劉俊田 任秀寶 (天津醫科大學附屬腫瘤醫院預防醫學中心天津市腫瘤防治重點實驗室 乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津300060)

吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)是肝臟以外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶。研究發現多種腫瘤組織中表達IDO，并誘導局部免疫抑制引起患者預后不良[1-4]。本課題組前期工作中發現乳腺癌組織局部高表達IDO，并且可以誘導局部T細胞的活化[5]，進一步研究發現局部表達的IDO和CD105標記的微血管密度相關[6]。本研究旨在通過細胞學實驗觀察IDO對HUVEC細胞形成管樣結構的能力影響，為進一步研究IDO促進血管形成的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-MB-453、SK-Br-3、T47D、ZR-75-1、MCF-7及HUVEC細胞系均由天津醫科大學附屬腫瘤醫院免疫室提供，MDA-MB-435S細胞在含10%FBS的DMEM細胞培養基中，5%CO2、37℃條件下單層貼壁培養;其余細胞在含10%FBS的RPMI1640細胞培養基中，5%CO2、37℃條件下單層貼壁培養。

1.2 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測IDOmRNA的水平 TRIZoL試劑(Gibco公司)一步法提取總RNA、紫外分光光度計測純度與濃度。IDO和β-actin引物均由大連寶生物公司設計并合成，引物序列見表1。采用SuperscriptⅡ逆轉錄試劑盒進行RT反應，總體系20 μl。反應條件:94℃預變性5分鐘;94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環;72℃完全延伸10分鐘。PCR產物加入1%瓊脂糖凝膠中，在0.5×TBE中進行電泳，紫外光下拍照記錄。

1.3 氨基酸分析儀檢測IDO活性 收集培養72小時后且生長狀態良好的MCF-7細胞上清。取2 ml樣品加入磺基水楊酸0.1 g，4℃ 18 000 r/min離心30分鐘，取上清液。測定條件:儀器為日立L-8800型全自動氨基酸分析儀;分離柱徑為4.6 mm×60 mm，離子交換樹脂 2622 SC型;緩沖液泵壓力6.90～7.90 kpa，流速 4.0 ml/min，茚三酮泵壓力0.89～1.00 kpa，流速 3.5 ml/min;分離柱柱溫57℃，反應柱柱溫134℃。上機檢測培養上清中游離氨基酸含量。

1.4 共培養體系的建立 取對數生長期的MCF-7和HUVEC細胞離心，調整HUVEC細胞濃度為1×105ml-1，調整MCF-7濃度至5×104ml-1。取1.5 ml HUVEC細胞接種于共培養模型的下室，上室分別接種0.5 ml的HUVEC，MCF-7和MCF-7細胞共三組，最后一組的培養液中含1-MT(終濃度為1 mmol/L)。取24、48、72小時三個時間點收集細胞，進行細胞計數及流式檢測。

1.5 流式細胞儀檢測CD105表達 將收集制備好的單細胞懸液置于Eppendorf管中，每管5×105個細胞，12 000 r/min離心3分鐘，棄上清，體系定為20 μl，混勻。每管加入 anti-105-FITC 10 μl，對照管中加入 anti-IgG2α-FITC 10 μl。充分混勻后4℃避光孵育40分鐘。PBS緩沖液洗滌，100 μl 1%多聚甲醛固定，上機檢測。

表1 人IDO和β-actin的引物序列和擴增長度Tab．1 The primer and amplification length of IDO and βactin

1.6 基質膠(Matrigel)成管實驗 取預冷的基質膠50 μl/孔均勻涂布96孔平板，置于37℃孵箱中30分鐘，將制備好的不同狀態的HUVEC接種于基質膠表面，培養6小時起不同時間點觀察細胞間連接形成的中空管樣結構。實驗重復3次。

1.7 統計學分析 采用SPSS13.0對數據進行統計分析，均數的比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，規定雙側檢驗P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞系中IDO基因的表達 人乳腺癌細胞系 MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-MB-453、SK-Br-3、MCF-7、T47D、ZR-75-1，半定量 RT-PCR 法檢測IDO基因的表達情況如下:IDO表達細胞系為MDA-MB-435S、T47D、MCF-7;在 MDA-MB-231、MDA-MB-453、SK-Br-3、ZR-75-1 各細胞系中亦有IDO表達(圖1)。

2.2 MCF-7細胞中IDO蛋白的表達活性 培養上清中可檢測到(8.12±1.01)mg/L的犬尿氨酸，而色氨酸未檢出(＜3 pmol)，表明MCF-7細胞中IDO的表達可以降解色氨酸，具有功能活性(圖2)。

2.3 IDO對HUVEC增殖的影響 以1×105ml-1的HUVEC種植于Transwell小室下層記為第1天，取第2、3、4天時間點，利用細胞計數法計數細胞數量，繪制細胞生長曲線(圖3)。共培養24小時時發現與MCF-7共培養后的HUVEC與另兩組差異均有統計學意義(P＜0.05)。繼續共培養48和72小時后，均數間比較有統計學差異。

圖1 細胞系中IDO陰性及陽性表達的篩選Fig．1 Analysis of IDO expression in different cell lines by agarose gel electrophoresis

2.4 流式細胞儀檢測CD105表達 共培養24小時時組間均數比較:各組兩兩比較差異均有統計學意義，P＜0.05。繼續共培養48、72小時后，組間均數比較與24小時情況一致。組內均數比較:三組內24、48、72小時時兩兩比較差異均有統計學意義，P ＜0.05(圖4、表2)。

圖2 氨基酸分析儀檢測培養細胞上清中游離氨基酸Fig．2 Free amino acid in culture supernatant

2.5 IDO對HUVEC成管能力的影響 將三種不同處理方式的HUVEC分別平鋪于基質膠，并連續觀察其所形成的中空管樣結構數目及形態。HUVEC在6小時時即有管樣結構形成，并逐漸增多，至24小時形成的管樣結構數目最多，48小時后管樣結構逐漸減少。與MCF-7共培養后的HUVEC管樣結構數目較多，HUVEC細胞多呈復層排列。培養液中加入1-MT，與MCF-7共培養后的HUVEC幾乎無管樣結構存在(圖5、表3)。

圖3 IDO對HUVEC增殖的作用Fig．3 Evaluated the effects of IDO on proliferation of HUVEC

圖4 不同共培養體系中HUVEC細胞CD105的表達率Fig．4 Evaluation of the CD105 expression in HUVEC by flow-cytometry analysis in different co-culture systems

表2 不同共培養體系中HUVEC-CD105表達率(±s)Tab．2 The CD105 expression in HUVEC in co-culture system(±s)

表2 不同共培養體系中HUVEC-CD105表達率(±s)Tab．2 The CD105 expression in HUVEC in co-culture system(±s)

HUVEC HUVEC(+MCF-7)HUVEC(+MCF-7+1-MT)24 h 5.90±0.97 16.91±1.12 9.16±0.38 48 h 13.53±1.33 45.13±6.32 21.99±3.06 72 h 7.99±0.52 27.30±1.83 19.80±1.05

表3 不同體系共培養后HUVEC細胞形成管樣結構數目[(±s)/×40]Tab．3 The number of vessel-like structures in different co-culture systems[(±s)/×40]

表3 不同體系共培養后HUVEC細胞形成管樣結構數目[(±s)/×40]Tab．3 The number of vessel-like structures in different co-culture systems[(±s)/×40]

HUVEC HUVEC(+MCF-7)HUVEC(+MCF-7+1-MT)6 h 4.33±1.00 14.00±1.22 1.00±0.87 12 h 6.00±0.86 16.67±1.12 1.33±0.71 24 h 7.44±1.42 19.67±2.00 2.00±0.71 36 h 4.22±0.67 17.56±1.42 1.22±0.67 48 h 3.56±0.88 15.22±1.2 0.67±0.71 72 h 2.67±0.71 12.33±1.22 0.44±0.72

3 討論

IDO作為肝外色氨酸代謝過程中的限速酶，與自身免疫、移植免疫及母胎耐受等多種發病機制相關。Uyttenhove等[7]首先發現，大部分人腫瘤細胞高表達IDO，并且多數研究認為IDO高表達是獨立的不良預后指標[1-4]。我們的前期研究發現在乳腺癌細胞中IDO的表達和腫瘤局部Treg細胞的分布密切相關，兩者共同參與腫瘤的局部免疫耐受而加速腫瘤進展[5]。目前關于IDO與腫瘤的相關研究主要集中在腫瘤免疫耐受方面，IDO與重力血管形成相關的報道較少。Hiroaki[8]在研究IDO與卵巢癌疾病進展的關系時發現IDO通過抑制腫瘤局部NK細胞的增殖和促進血管形成加速卵巢癌的進展，該研究利用基因轉染的方式獲得表達IDO的卵巢癌細胞系OMC-1/IDO，體內試驗發現IDO可以促進腫瘤生長和轉移，同時免疫組化結果顯示OMC-1/IDO腫瘤組織中每高倍視野平均有(8±1)個新生血管而OMC-1腫瘤組織中僅為(3±1)個，具有統計學差異。本課題組前期工作中發現乳腺癌組織局部高表達IDO且與CD105標記的微血管密度成正相關[6]，本研究旨在通過細胞學實驗觀察IDO對HUVEC細胞成管能力的影響，為進一步研究IDO促進血管形成的機制提供實驗基礎，從而為研究腫瘤的發生發展機制提供新的思路。

CD105是一種增殖相關蛋白，與CD31、CD34等泛內皮標志物相比，CD105能更準確地反映內皮細胞的增殖。Charpin等[9]對360例乳腺癌石蠟標本進行了CD31、CD105的檢測，經過14.3年的隨訪發現，CD105與患者總生存和無轉移生存顯著相關，而CD31與患者預后無關。Kumar等[10]采用抗CD105抗體觀察了106例乳腺癌組織中微血管密度與病人預后的相關性，多因素分析顯示用CD105測定微血管密度值是一個獨立的預后指標。我們利用流式細胞儀檢測了 HUVEC表面CD105的表達情況，與MCF-7共培養后HUVEC表面CD105的表達率較獨立培養的HUVEC表達率更高，但是在共培養中加入IDO抑制劑1-MT后，HUVEC的增殖以及其表面CD105的表達率均受到抑制，這提示我們IDO在HUVEC的增殖以及活化中發揮了一定的作用。基質膠成管實驗顯示腫瘤細胞可以明顯促進HUVEC細胞間的細胞連接增多，管樣結構形成增多，加入1-MT后，管樣結構減少，進一步驗證了IDO可以加速新生血管形成。

本實驗中我們利用Transwell小室共培養模型，觀察到體外環境中IDO能夠提高HUVEC成管能力，但是其具體機制有待于進一步研究。Li等[11]的研究發現在異種移植皮膚內IDO能夠誘導血管形成。體內實驗發現經腺病毒轉染高表達IDO的成纖維細胞移植片的傷口毛細血管樣管腔的數量在第8天會明顯增加。該研究認為其機制與色氨酸代謝產生的犬尿氨酸引起的毒性反應無關，而與色氨酸缺乏有關，環境中的色氨酸缺乏作為刺激因子引起了一系列的反應從而促進了內皮細胞的增殖、活化，形成毛細血管。我們的研究證實IDO可以促進HUVEC形成管樣結構，其機制可能與色氨酸缺乏有關，具體機制有待于進一步研究。

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2 Munn D H，Zhou M，Attwood J T et al.Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism[J].Science，1998;281(5380):1191-1193.

3 Uyttenhove C，Pilotte L，Theate I et al.Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2，3-dioxygenase[J].Nat Med，2003;9(10):1269-1274.

4 Munn D H，Sharma M D，Hou D et al.Expression of indoleamine 2，3-dioxygenase by plasmacytoid dendritic cells in tumor-draining lymph nodes[J].J Clin Invest，2004;114(2):280-290.

5 魏麗娟，于津浦，叢義滋et al.吲哚胺2，3-雙加氧酶參與乳腺癌患者免疫耐受的研究[J].中國免疫學雜志，2009;25(11):987-990，995.

6 劉俊田，魏麗娟，于津浦 et al.吲哚胺2，3-雙加氧酶在乳腺癌中的表達及其與預后的關系[J].中華腫瘤學雜志，2011;33(7):513-516.

7 Uyttenhove C，Pilotte L，Theate I et al.Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2，3-dioxygenase[J].Nat Med，2003;9(10):1269-1274.

8 Hiroaki Nonaka，Yasushi Saga，Hiroyuki Fujiwara et al.Indoleamine 2，3-dioxygenase promotes peritoneal dissemination of ovarian cancer through inhibition of natural killercell function and angiogenesis promotion[J].Inter Oncology，2011;38:113-120.

9 Charpin C，Dales J P，Garcia S et al.Tumor neoangiogenesis by CD31 and CD105 expression evaluation in breast carcinoma tissue microarrays[J].Clin Cancer Res，2004;10(17):5815-5819.

10 Kumar S，Ghellal A，Li C et al.Breast carcinoma:vescular density determined using CD105 antibody correlates with tumor prognosis[J].Cancer Research，1999;59:856-861.

11 Li Yunyuan，Edward E，Abdi G et al.Local expression of indoleamine 2，3-dioxygenase protects engraftment of xenogeneic skin substitute[J].Invest Dermatology，2006;126:128-136.