動物模型評價化妝品原料美白功效的研究

秦 瑤，程樹軍，黃健聰，張俊賓

(1．廣東檢驗檢疫技術中心，廣州 510623;2．廣州市華代生物科技有限公司，廣州 510130)

皮膚美白劑的研發及其功效評價方法與黑色 素形成生物學機制的認識密切相關。近年來，隨著對人體黑色素形成通路、基因調控、信號傳導等生物學機制的深入了解，以及體外培養技術、分子生物學技術和皮膚生物物理學檢測技術的發展，美白劑的評價逐漸傾向于采取以機制為導向的組合評價策略［1］。體外酶抑制法用于原料初篩，細胞法用于機制研究和初篩［2］，人體臨床試驗用于配方或成品的功效確認等［3］。雖然角質細胞攝取試驗、3D皮膚模型等新的非整體動物的體外方法在原料篩查階段已得到應用［1，4］，但尚不能完全模擬化妝品活性成份在體內功效作用的復雜機制。動物法能較好地彌補上述幾種方法的不足，基于動物模型的美白評價方法可以在體外初篩的基礎上起到進一步明確作用效果的作用［1］，成為整合運用體外方法、體內動物試驗和臨床評估化妝品美白功效的重要環節。本文選取花色豚鼠為實驗動物，建立紫外線誘發皮膚黑化模型，利用皮膚生物物理檢測技術，結合組織化學染色及圖像分析技術對皮膚內的黑素顆粒定量，應用于美白化妝品的功效評價。

1 材料和方法

1.1 試劑及配制

L-多巴、白藜蘆醇、熊果苷和戊巴比妥鈉(購自Sigma公司)，氯化金、核固紅、五水合硫代硫酸鈉(均購自國藥集團化學試劑有限公司)，硝酸銀(購自天津市贏達稀貴化學試劑廠)，伊紅蘇木素試劑盒和中性樹膠封片劑(廣州維格斯生物科技有限公司)，多聚甲醛和氨水(廣州化學試劑廠)。其余試劑均為市售分析純。白藜蘆醇(RV)，先用乙醇溶解，再用無菌水加溫稀釋，配成終濃度為0.05mM的溶液，熊果苷(AB)，先用無菌水50℃溶解，再配成5 mM的溶液，熊果苷-白藜蘆醇(AR)溶液，上述RV溶液和AB溶液等比例混合。

1.2 儀器設備

皮膚光毒性試驗儀(Hope-med 8130A型，天津合普公司)，膚色測定儀(德國CK公司 mexmeter 18)，生物組織脫水機(Leica TP 1020)、染色機(Leica ST 5010)和石蠟切片機(Leica RM 2255)，顯微鏡及照相系統(德國 Leica DM2000)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(美國Media Cybernetics公司)。動物實驗用斑試器購自廣州國裕醫學有限公司，直徑2 cm，容積1 mL。

1.3 實驗動物

普通級健康成年棕黃色Hartly豚鼠，雌性，30只，體重(250±20)g。購自廣東省醫學動物中心，動物合格證【SCXK(粵)2008-0002】。實驗在廣東檢驗檢疫技術中心進行，使用許可證【SYXK(粵)2008-0086】。

1.4 皮膚黑化模型

隨機選擇10只豚鼠制作模型，取棕色皮膚部位，去除被毛，經UVB紫外線照射，波長為310 nm，累計照射總量5000 mJ/cm2。每天照射1次，每次1 h，持續7 d，未照射部位以斑試器覆蓋。定時檢測皮膚MI和EI指數，停止照射7 d后，處死動物取皮膚組織。

1.5 原料美白作用評價

20只動物隨機分為2組，美白劑組10只，空白對照組10只。美白劑組先經紫外線照射成皮膚黑化模型，在每只豚鼠背部取相對獨立的4塊區域作為給藥區，分別為AB組、RV組、AR組和對照組。取封閉式斑試器，將受試物約(0.8±0.2)mL置于斑試器內，與皮膚直接接觸，固定斑試器，敷用時間為6 h，試驗結束后用溫水清除殘留受試物。模型對照區域每次涂抹0.9%生理鹽水1 mL。連續給藥5周，安樂處死動物后取皮膚組織。

1.6 皮膚顏色測定

造模前、造模后、試用產品前及使用產品后用mexmeter儀檢測紅色素指數(EI)和黑色素指數(MI)，基于單光譜反射和吸收的原理，獲得皮膚EI和MI含量數據。

1.7 組織學染色

所取皮膚組織經10%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟切片，分別進行如下組織化學染色。L-多巴染色:切片經脫蠟處理，0.1%L-多巴溶液中37℃浸泡4 h，鏡下觀察染色變化，PBS沖洗，蒸餾水沖洗，HE復染。Fontana-Masson氨銀染色:切片經脫蠟處理和水洗后，置于氨銀溶液中，60℃水浴放置60 min，用0.1%氯化金染色10 min，去離子水沖洗，再用5%Na2S2O3溶液浸泡5 min，分別用自來水和去離子水沖洗，最后用0.2%核固紅染色5 min，去離子水沖洗。常規脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片。

1.8 圖像分析

對染色后組織學切片進行顯微拍照，采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對圖像進行如下分析。參考文獻對L-多巴染色的黑色顆粒進行分級［5］，1級:基底細胞和棘層偶見黑素顆粒;2級:黑素顆粒分布以基底層為主，且分布不連續;3級:基底細胞和棘層均可見呈連續帶狀分布的黑素顆粒;4級:基底細胞和棘層可見大量呈連續帶狀分布的黑素顆粒，且角質細胞內可見較多黑素帽(附著于細胞核的黑素顆粒呈帽狀);5級:表皮全層密布黑素顆粒，可見較多黑素帽。參考文獻對氨銀染色的組織切片進行光密度分析［6］，并作修改。光密度/黑色素細胞面積(L/M):指黑素顆粒占黑色素細胞面積的百分率，表明黑色素細胞內黑素顆粒的含量。光密度/表皮細胞面積(L/K):指黑素顆粒占表皮角質層細胞面積的百分率，表明黑素顆粒遷移到角質層的含量。光密度/表皮層面積(L/E):指黑素顆粒占全部表皮層的面積的百分率，表明黑素顆粒在表皮中的含量。每個樣品隨機拍攝30張照片進行處理和分析。

1.9 統計學處理

數據采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析，兩組間數據比較采用t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 紫外線皮膚黑化模型

紫外線照射前后，膚色測定和多巴染色、氨銀染色結果見表1。棕色皮膚經UVB照射后，MI顯著升高，EI指數明顯下降。組織化學染色顯示黑素含量均明顯增大，黑素顆粒染分級接近5級。L/M、L/K和L/E的值照射前后相比均具有顯著性差異。表明采用累計總量達5000 mJ/cm2左右的UVB照射，可以造成豚鼠皮膚黑化模型。

2.2 美白功效比較

紫外線造模后皮膚分別涂抹熊果苷(AB)、白藜蘆醇(RV)和熊果苷-白藜蘆醇復配物(AR)，皮膚顏色指數測定、L-多巴染色黑素顆粒分級和氨銀染色圖像分析結果見表2。L-多巴和氨銀組織化學染色見圖1和圖2(圖1，圖2，彩插5)。

皮膚顏色測試表明，美白劑組與模型組比較，MI明顯降低，EI明顯升高，復合化合物組(AR)比單一AB組和RV組皮膚MI下降更顯著。RV對EI指數的改善較MI指數明顯，提示RV對紅色素提升效果優于AB。黑素顆粒分級結果表明AR組分級明顯下調。

表1 UVB照射前后皮膚測試結果比較Tab．1 Skin test results compared before and after irradiation

表2 不同美白劑配方效果比較Tab．2 Compare the effect of different whitening agent

組織化學圖像分析表明，美白劑組與模型組相 比，皮膚內黑素含量顯著降低，L/M、L/E、和L/K均有不同程度下降，統計數據具有顯著性差異，以AR組各指標下降最為顯著。相比之下，AB組對L/M的下降較RV組明顯，而RV對L/E和L/K的影響較顯著。提示使用白藜蘆醇30 d后，對表皮細胞內黑色素顆粒的含量影響較顯著，而AB對黑色細胞內顆粒的合成影響較明顯。

3 討論

利用動物模型研究美白劑的功效和作用機制是美白產品研發的重要依據，本文利用紫外線造成豚鼠皮膚黑化模型，運用皮膚臨床檢測、組織化學染色及圖像分析等多種技術手段研究美白劑的功效，把臨床監測和組織學顯微分析相結合，提高了動物模型的使用效率。

把無創性皮膚定量檢測儀用于動物皮膚顏色變化的檢測，提供了一種客觀動態的評價方法，但與人體臨床試驗一樣，也應保持檢測環境的恒溫、恒濕和光線穩定［3］。利用圖像分析軟件對組織切片進行黑素顆粒分級和黑素含量分析應控制染色的質量和不同染色方法之間的對比。本文觀察了兩種染色方法對檢測結果的影響，結果表明，組合染色法能對不同美白劑之間的效果差異較好地區分，復合使用熊果苷-白藜蘆醇，能顯著提高美白效果，所得結果均具有顯著性差異。L-多巴染色適合黑素顆粒的分級，該方法利用黑素細胞內的多巴氧化酶對多巴氧化進行染色，而多巴氧化酶特異性地存在于黑素細胞內，劉榮等認為多巴染色法的特異性和靈敏度更高一些［6］。氨銀染色法是因為黑素具有還原性，能將氧氧化銀氨液內的銀離子還原成金屬銀而成黑色，適合對整張切片的光密度進行分析。這兩種方法的缺點是特異性不強，近年來，分子生物學研究發現，多種美白劑和抗氧化劑與黑色素形成中的MITF、HMB45等有關，因此，如果補充MITF、S100以及HMB45等表征黑色素細胞的特異標志物的免疫組化方法可提高動物模型應用于作用機制的研究［7］。

人體皮膚黑色素的形成是一個非常復雜的生物學過程，由于不同美白劑的作用機制差異很大，不同試驗體系獲得的結果可能存在差異［8］。如體外蘑菇酪氨酸酶測試白藜蘆醇抑制活性是曲酸的40倍，小鼠B16細胞的研究也表明白藜蘆醇去色素效果可能與其抑制MITF和酪氨酸酶啟動子活性有關［2］，但用正常人黑色素細胞沒有得出相同的研究結論［9］。白藜蘆醇經證實的主要生物學作用是下調血管活性肽(如內皮縮血管肽 ET-1)活性［10］，而ET-1是重要的促黑素合成和黑素細胞增生的分裂原。RV還可調節凋亡信號通路，對抗因紫外線照射誘發皮膚細胞內自由基升高引起的損傷作用［11］。經研究證實白藜蘆醇對表皮細胞的保護作用是通過與表皮細胞膜特異性的多酚受體結合［12］，而對黑色素細胞的作用是直接抑制其活性而不影響其基因表達。熊果苷雖是氫醌的衍生物，其細胞毒性較氫醌低，是公認的抑制黑色素合成和轉運的化合物，它通過競爭性和可逆性地與酪氨酸酶結合而抑制黑色素的形成，并不影響酪氨酸酶的RNA轉錄［13］，而且高劑量使用反而可能引起黑色素的異常增生，因而其在產品中的使用濃度通常控制在5%以內。本文研究表明，單純使用白藜蘆醇對于皮膚的美白效果不如熊果苷，采用二者聯合復配，不僅可降低熊果苷的使用濃度，而且美白效果有顯著提高，紅細胞指數明顯上升，表皮細胞內黑素顆粒下降明顯。提示在膚色變白的同時，復配后通過血紅素的變化間接影響膚色。推測白藜蘆醇所起作用可能與對抗因紫外線造成的氧化應激和自由基損傷，緩解毛細血管緊張程度和抑制黑素顆粒向表皮細胞的轉運有關。

從天然植物中開發化妝品活性原料已成為一種潮流［14］，而且多種生物活性物質配合使用可明顯相互促進各自本身的功效，如防曬產品中添加保濕劑提高防曬指數，美白產品中添加抗氧化劑提高美白功效等［15］。本研究結果也表明，復合使用熊果苷-白藜蘆醇能顯著提高美白效果，使組織中的黑素顆粒生成和分布明顯減少。本研究表明使用動物模型試驗對于整體水平美白功效評價是有價值的，為下一步人體臨床試驗確認美白效果提供依據。

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