缺血性眩暈大鼠模型的建立

劉 陽，孫建寧，王 堃，李俊青，董世芬，張碩峰，張勝威，武 汀

(北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 100102)

缺血性眩暈是指前庭感受器、前庭神經及相應中樞缺血導致功能紊亂而引起的眩暈。現有的實驗性眩暈動物模型主要由家兔結扎椎動脈模型，家兔頸椎旁注射硬化劑模型和小鼠旋轉致暈模型，這些模型由于手術復雜、缺血程度差異大、動物費用較昂貴或眩暈機制不同等原因，均無法作為合適的缺血性眩暈動物模型。本研究旨在建立一種切實可行并且操作簡單的缺血性眩暈動物模型，通過結扎CCA和SCA致大鼠右側半腦不完全腦缺血，并針對缺血和眩暈兩個疾病特點，觀察天保寧和鹽酸地芬尼多對模型動物的治療作用，以印證模型的可塑性和適用性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:健康 SD大鼠，雌雄各半，體重180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，動物使用許可證【SYXK(京)2011-0024】。適應性喂養3 d后進入試驗。

1.1.2 實驗藥品:鹽酸地芬尼多片，山東仁和堂藥業有限公司產品，批號110103。規格:每片含主要成分地芬尼多 25 mg。人用量為 3次/d，2片/次。按60 kg體重計，大鼠等效量相當于人用量6倍計算，大鼠受試劑量為15 mg/kg。天保寧:浙江康恩貝制藥股份有限公司產品，批號:031213。規格:每片含9.6 mg總黃酮醇苷，萜類內酯2.4 mg。人用量為3次/d，2片/次，按60 kg體重計，大鼠等效量相當于人用量6倍計算，大鼠受試劑量為5.76 mg/kg(以總黃酮醇苷含量計算)。

1.1.3 實驗儀器:400R低溫離心機(德國Heraeus有限公司);YLS-3TB跳臺記錄儀(濟南益延科技發展有限公司);三維立體腦定位儀(美國-ASI儀器公司);激光多普勒血流儀(美國BIO公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 缺血性眩暈大鼠模型的建立 大鼠采用10%水合氯醛(0.35 mL/100g體重)麻醉后，仰臥位固定。剪開頸部皮膚，鈍性分離肌肉，暴露并分離右側CCA，穿線結扎;沿右側CCA向胸腔內找至與右側 SCA的分叉處，用彎鑷勾出右側 SCA，穿線結扎。

1.2.2 旋轉刺激缺血性眩暈模型大鼠跳臺逃避時間實驗

1.2.2.1 分組及給藥 SD大鼠56只，按體重隨機分為4組，即假手術組、模型組、鹽酸地芬尼多組、天保寧組。

灌胃給藥，1次/d，共4次，假手術給予等量飲用水(10 mL/kg體重)。第4日于術后各組大鼠清醒后給藥，給藥后1h進行跳臺逃避電刺激實驗。

1.2.2.2 跳臺逃避電刺激反射訓練 每日給藥1 h后進行跳臺逃避電刺激反射訓練。將大鼠放入跳臺儀中，適應3 min后連續給予電刺激5 min，電刺激強度30 V、50 Hz。以大鼠跳上平臺并保持30 s為訓練成功，每日訓練2次，連續訓練3 d，以建立牢固的大鼠逃避電刺激的條件反射。

1.2.2.3 眩暈測試 按照1.2.1方法復制缺血性眩暈大鼠模型。假手術組大鼠僅剝離CCA及SCA，不結扎血管。于術后各組大鼠清醒后給藥，給藥1 h后將大鼠放入離心機內以500 r/min的速度勻速旋轉30 s驟停，立即置于跳臺儀中，記錄從大鼠受到電刺激至第1次跳上平臺并且30 s內不跌落所需的時間(不包括大鼠在平臺上的時間)，記為潛伏期。

1.2.3 缺血性眩暈模型大鼠前庭神經核組織血流量的變化

1.2.3.1 分組及給藥 SD大鼠44只，按體重隨機分為3組，即對照組、模型組、天保寧組。各組灌胃給藥，1次/d，共3次，模型組給予等量飲用水(10 mL/kg體重)。第3日給藥后1 h開始實驗。

1.2.3.2 前庭神經核組織血流量的測定 按照1.2.1方法分離大鼠 CCA及 SCA，穿線備用(不結扎)。將手術后大鼠固定在三維腦立體定位儀上，采用平顱頭位，距前囟10.2 mm，中縫右側1.1 mm～2.5 mm，深4.5 mm～5.5 mm處，定位大鼠右側前庭神經核［1］，使用激光多普勒血流儀，測定右側前庭神經核組織血流量，描記正常血流曲線，待血流平穩后，結扎右側 CCA、SCA，并繼續描記血流曲線30min。記錄結扎動脈前、結扎動脈后5、10、15、20、25、30 min的血流值(每時間點記錄1 min的平均血流值)。對照組大鼠不結扎血管。

表1 各組大鼠旋轉刺激后跳臺逃避時間的比較Tab．1 Comparison of escape time of platform test in the rats stimulated by rotation

表2 各組大鼠結扎CCA及SCA后前庭神經核組織血流量下降率的比較Tab．2 Comparison of the decrease rate of blood flow of vestibular nucleus in the rats after ligating the CCA and SCA

1.2.4 統計方法 運用SPSS14.0進行數據統計分析，數值采用表示，組間比較采用ONEWAYANOVA分析，方差齊則用 LSD檢驗，否則用Dunnett’s T3 檢驗。

2 結果

2.1 旋轉刺激缺血性眩暈模型大鼠跳臺逃避時間實驗

受離心機旋轉刺激的大鼠無法準確控制肢體運動，表現為翻滾、轉圈、步態不穩等，因而給予電刺激后無法迅速跳上平臺逃避，或跳上平臺后無法保持穩定(不少于30 s)而跌落。只有當眩暈基本消失、慢慢恢復清醒后，大鼠才能跳上平臺并保持穩定不跌落。記錄從大鼠受到電刺激至第1次跳上平臺并且30 s內不跌落所需的時間(不包括大鼠在平臺上的時間)，記為潛伏期(表1)。與假手術組相比，模型組大鼠潛伏期顯著增加(P ＜0.01)，造模成功。與模型組比較，鹽酸地芬尼多組大鼠潛伏期明顯縮短61.9%(P＜0.01)，天保寧組大鼠潛伏期縮短52.0%(P＜0.01)，差異具有顯著性。

2.2 缺血性眩暈模型大鼠前庭神經核組織血流量的變化

分別計算各組大鼠結扎 CCA及 SCA后5、10、15、20、25、30 min 血流量下降率(表 2)。模型組大鼠結扎動脈后，前庭神經核組織血流量明顯減少，血流量隨著時間增加下降更加明顯。與模型組相比，天保寧可顯著減小結扎動脈后組織血流量下降率，增加組織血流量，在結扎后 5、10、15、20、25、30 min血流量下降率分別減少 92.8%、83.8%、77.3% 、77.9% 、65.7% 、55.8%(P ＜ 0.01)。

3 討論

眩暈是一種常見的臨床癥狀，發病率在10%以上［2］，臨床表現為平衡失調、站立不穩、傾倒、指物偏向等癥狀，嚴重影響患者的生活［3］。研究表明腦血管病是引起眩暈的重要病因，占85.4%，其中又以椎-基底動脈供血不足最為多見，占76%［4］。

實驗性眩暈動物模型的建立主要選用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等實驗動物。目前造模方法主要為3類。(1)手術結扎椎動脈法。如倪健強［5］用25%烏拉坦靜脈麻醉家兔，取頸部正中切口切開皮膚至第一肋骨上緣，分離出氣管，予以氣管插管，沿右側鎖骨下動脈找到右側椎動脈并結扎，造成椎基底動脈供血障礙。(2)頸椎旁硬化劑注射法，如鄭重［6］、朱明雙［7］用自制硬化劑775注射液10mL注射于家兔第3～5頸椎左側橫穿側面，并于第2周重復1次，造成一側椎動脈被壓迫或牽扯致椎基底動脈供血障礙。(3)動物旋轉法，如傅繼華［8］選用小鼠，通過訓練使其建立起逃避電刺激反射，然后通過旋轉使動物產生眩暈。此外，Miyoshi向家兔右椎動脈內注射二磷酸腺苷(0.3mg/kg b．w．)造模成椎-基底動脈系統短暫腦缺血發作模型。上述3類造模方法中，手術結扎椎動脈法可有效導致腦缺血，但是手術較為復雜，不易于大量復制模型;頸椎旁硬化劑注射法與缺血性眩暈臨床病因最為相符，但該法不易于控制狹窄程度，因而動物缺血程度會產生較大差異，不利于藥效評價。并且上述兩種方法采用的實驗動物為家兔和豚鼠，成本較高，在新藥藥效篩選和藥效評價的應用上受到限制。小鼠旋轉致暈法雖然致暈效果穩定、明顯，但是其眩暈機制與缺血性眩暈機制相差甚遠，不能夠作為缺血性眩暈模型來使用。

本模型通過結扎CCA和SCA造成前庭感受器、前庭神經核及相應中樞缺血。前庭感受器球囊、橢圓囊和半規管對迷路動脈供血變化頗為敏感，血流稍有減少即可產生惡心、嘔吐、眩暈等平衡障礙［9］。前庭供血的主要來源是小腦前下動脈(AICA)［10］。AICA起源于基底動脈的近心端前2/3處［11］，基底動脈起于 CCA 的前緣［12］。大鼠右側CCA與SCA于胸鎖關節的水平位置匯合成無名動脈，無名動脈起源于主動脈弓，因而沿大鼠右側CCA向胸腔方向可找到SCA;大鼠左側CCA與SCA不匯合，兩者分別起源于主動脈弓，尋找SCA較困難，故分離結扎右側 CCA和 SCA較為方便可行。與現有3種實驗性眩暈動物模型相比，采用手術結扎右側CCA和SCA致大鼠右側半腦不完全腦缺血建立缺血性眩暈大鼠模型這種方法更加簡單易行，且缺血差異較小，缺血程度穩定，與缺血性眩暈臨床病因更為相符;選用大鼠作為實驗動物，較家兔、豚鼠等更為經濟。

天保寧為銀杏葉提取物，具有增加腦部供血，改善腦功能的作用。研究表明銀杏葉提取物可能通過銀杏苦內酯稀釋血液，降低血黏度，改善腦循環，增加腦血流量發揮作用［13，14］。與此同時，銀杏內酯可降低麻醉犬腦血管阻力，增加腦血流量［15］。鹽酸地芬尼多可改善椎底動脈供血，調節前庭系統功能，可用于各種原因引起的眩暈癥，如椎基底動脈供血不全、美尼爾病、植物神經功能紊亂、暈車暈船等。缺血性眩暈主要的疾病特點是缺血和眩暈，天保寧和鹽酸地芬尼多針對這兩個不同的環節，有各自的治療特點，即改善血流和治療眩暈，具有一定代表性。并且這兩個環節可能成為治療缺血性眩暈的主要環節。因此，采用這兩個藥，觀察藥物對于模型的治療作用，以印證模型的可塑性和適用性。

由實驗結果可見，本模型腦部明顯缺血，天保寧可明顯增加缺血部位血流量;旋轉刺激后大鼠無法準確控制肢體運動，翻滾、轉圈、步態不穩等眩暈表現明顯可見，通過潛伏期來反映動物眩暈程度及時間長短，鹽酸地芬尼多可顯著縮短模型大鼠潛伏期時間。本研究建立了一種缺血性眩暈大鼠模型，可有效應用于抗缺血性眩暈藥物的研究。

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