caspase-1影響乳腺癌的生長及其對髓源性抑制細胞發育的調控作用①

陳勇軍 鄭 薇 牛志遠 吳 珍 沈萍萍

(南京大學生命科學學院，醫藥生物技術國家重點實驗室，南京210093)

腫瘤是一個由多種細胞組成的異質性組織。除了腫瘤細胞之外，在腫瘤微環境中還存在多種類型的非腫瘤細胞，包括血管內皮細胞、基質成纖維細胞以及一些骨髓來源的免疫細胞(如髓源性抑制細胞、腫瘤相關巨噬細胞、肥大細胞和嗜中性粒細胞等)[1]。其中髓源性抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一類不成熟的髓細胞，由單核細胞、粒細胞和髓系祖細胞等構成[2]。小鼠的MDSCs細胞表面能特征性地表達CD11b和Gr-1。根據形態上的差別，MDSCs可進一步分為單核的髓源性抑制細胞(Monocytic-MDSCs，M-MDSCs)和多形核的髓源性抑制細胞(Polymorphonuclear-MDSCs，PMN-MDSCs)[3]。MDSCs在腫瘤病人和荷瘤小鼠中會大量擴增，并在血液、骨髓、淋巴結、脾臟和腫瘤等部位積累。MDSCs能抑制T細胞的功能，削弱機體的免疫監視和抗腫瘤免疫，從而促進腫瘤生長[4]。腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環境普遍存在的一類非實質細胞，幾乎所有的實體瘤都能招募TAMs。TAMs具有與M2型巨噬細胞類似的表型，能夠促進血管新生、基質重塑。TAMs具有促腫瘤的能力;腫瘤病人中TAMs的密度與不良的預后密切相關[5]。

caspase-1屬于胱天蛋白酶家族中的一員，它能夠調控細胞凋亡和炎癥反應，與腫瘤發生發展中有密切聯系。臨床研究發現，caspase-1的表達在結腸癌、前列腺癌和卵巢癌等腫瘤中是下調的，而過表達caspase-1則能誘導腫瘤細胞的凋亡[6-8]。caspase-1作為典型的炎癥相關caspase，還能夠調控腫瘤微環境中的炎癥反應和機體的抗腫瘤免疫。在腸炎相關的結腸癌模型中，炎癥小體(Inflammasome)介導caspase-1的激活和IL-18的釋放可以有效保護上皮細胞的完整性，并能防止腸炎和結腸癌的發生[9-11]。而壞死的腫瘤細胞釋放出的危險信號可以激活NLRP3炎癥小體和IL-1β的釋放，并誘發IL-1β依賴性的獲得性免疫，進而抑制腫瘤的生長[12]。這些結果揭示caspase-1具有重要的抗腫瘤功能。然而caspase-1對于腫瘤微環境中各種對腫瘤發展起促進作用的骨髓來源細胞(如MDSCs、TAMs)的調控作用還不是清楚。

本研究中我們利用4T1細胞成功構建了原位種植性乳腺癌模型，并在此模型中發現，caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-CMK(YVAD)能夠促進腫瘤的生長。進一步研究發現，YVAD能夠促進荷瘤小鼠外周血、脾臟和腫瘤部位MDSCs的積累;而不影響腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)的浸潤和分化。因此，這些結果揭示caspase-1能夠通過負調控腫瘤微環境中MDSCs細胞的發育而抑制腫瘤的生長。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c雌性小鼠(8～10周齡)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。免疫組化試劑盒購自福州邁新生物公司。CD11b-PE、F4/80-FITC抗體和anti-F4/80抗體購自eBioscience，Gr-1-PerCP-Cy5.5購自 BD Bioscience，Ac-YVAD-CMK購自Bachem，M-CSF購自Peprotech，Collagase IV和DNase I購自 Sigma。

1.2 原位種植性乳腺癌模型和給藥 BALB/c雌性小鼠(8～10周齡)飼養于南京大學醫學院SPF級動物房中。小鼠乳腺癌細胞4T1培養在含10%胎牛血清的DMEM(購自Invitrogen)中，收集對數生長期的4T1細胞，用PBS重懸，控制其密度為1×107cells/ml。取10 ml細胞懸液接種于BALB/c小鼠左側的前肢和后肢脂肪乳腺脂肪墊處。腫瘤接種后第5天開始給藥Ac-YVAD-CMK，劑量為5 mg/kg，每天腹腔注射一次(YVAD組);溶劑對照組注射相同量的DMSO(DMSO組)。另設未接種4T1腫瘤細胞的、注射DMSO的正常小鼠組(None)。在指定時間處死小鼠，進行后續實驗分析。

1.3 骨髓細胞的分離 運用短頸法處死小鼠，并用酒精消毒。在超凈臺內用手術剪在股骨關節外側靠近脊柱位置剪下其后肢，然后剃出肌肉和結締組織。將股骨和脛骨間的兩端的關節剪開，用注射器吸取RPMI 1640(購自Invitrogen)，并將骨髓細胞吹到培養皿里面。用40 μm濾網進行過濾，并將細胞懸液轉移至15 ml離心管中。1 200r/min，離心10分鐘，棄上清，加入1 ml紅細胞裂解液裂解紅細胞，并再次離心。用RPMI1640重懸細胞，加入M-CSF(100 ng/ml)誘導分化為巨噬細胞，或用于后續的流式細胞儀分析。

1.4 腫瘤細胞的分離 取出腫瘤組織，置于培養皿中，PBS洗滌一次，然后剪碎。加入適量的膠原酶液(含 1 mg/ml collagase IV 和 300 U/ml DNase I的Hanks溶液)，用注射器的末端充分研磨，放在37℃細胞培養箱進行消化，共消化大約30分鐘，每隔十分鐘搖晃一下。將上述組織液用100 μm的濾網過濾至50 ml的離心管中，再用40 μm濾網過濾一次。低速離心一次(500 r/min，1分鐘)，然后1 200 r/min離心10分鐘，并用PBS重復洗滌一次。PBS重懸細胞用于后續的流式細胞分析。

1.5 流式分析 收集細胞于1.5 ml Eppendorf(EP)管中，1 800 r/min離心5分鐘 (4℃)，再用含2%BSA的PBS洗滌一次。然后加入100 μl抗體工作液(1∶20稀釋)，重懸細胞;陰性對照樣品中加入相應的同型IgG熒光抗體。冰上避光孵育30分鐘，期間不斷搖動EP管，以防止細胞沉積。用預冷的PBS洗滌3次，1 800 r/min離心5分鐘。加500 μl PBS重懸細胞后上樣進行流式分析。

1.6 免疫組化 取出腫瘤組織樣本，保存于4%多聚甲醛溶液中，然后石蠟包埋并進行切片處理。后續操作步驟按照免疫組化試劑盒的操作說明進行。首先對切片進行脫蠟水化處理和抗原修復處理，并使用3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶。然后使用山羊血清室溫封閉10分鐘，加入 F4/80抗體(1∶50稀釋)，室溫孵育1小時;洗滌后加入對應二抗(1∶50稀釋)，室溫孵育10～15分鐘。接著使用DAB顯色5～10分鐘，蘇木精復染3～4分鐘，自來水沖洗干凈。最后乙醇脫水，二甲苯洗滌3次，中性樹脂封片。經免疫組化染色后的切片便可進行顯微鏡拍照觀察和分析。

2 結果

2.1 YVAD促進腫瘤的生長 YVAD能夠加劇脾腫大并促進腫瘤生長 小鼠乳腺癌細胞4T1注射到BALB/c雌性小鼠乳腺脂肪墊后，能夠在注射部位形成腫瘤原發灶，同時還能產生轉移;其病理特征與人體中的乳腺癌十分相近，是研究乳腺癌的理想動物模型[13]。我們在8～10周齡BALB/c雌性小鼠左側乳腺脂肪墊中注入105個4T1細胞，大約一個星期后可以觀察到黃豆大小的腫瘤原位灶的形成(結果未顯示);而接種后第15天時可觀察到體積明顯增大的實體腫瘤(圖1A)。在接種腫瘤細胞后的第5天，我們將小鼠隨機分組，每組6～7只，實驗組腹腔注射YVAD(5 mg/kg)，對照組則注射相同體積的DMSO。然后分別在腫瘤種植后的第10、15和20天處死小鼠。我們發現第20天時YVAD給藥組中腫瘤重量顯著高于DMSO組(圖1B)。與正常小鼠比較，DMSO組和YVAD組中荷瘤小鼠的脾臟都明顯腫大，而YVAD給藥組較DMSO組的脾腫大程度更為嚴重(圖1C和 D)。以上結果表明，抑制caspase-1的活性能夠加劇乳腺癌荷瘤小鼠的脾腫大程度并促進腫瘤的生長。

2.2 YVAD促進外周血和脾臟中PMN-MDSCs的積累 YVAD給藥會加重荷瘤小鼠體內脾腫大的程度(圖1D)，這提示caspase-1的活性可能與免疫細胞的發育相關。為了系統性地研究YVAD給藥對于荷瘤小鼠體內MDSCs細胞發育的調控作用，我們對其外周血、脾臟和骨髓中的MDSCs細胞數量進行了分析。結果顯示，與正常小鼠相比，荷瘤小鼠的外周血中FSChiSSChi細胞所占比例顯著增加(P＜0.01)，而FSClowSSClow細胞數量則顯著減少(P＜0.01);并且YVAD給藥能進一步改變 FSChiSSChi和 FSClowSSClow細胞數量的比例(圖2A)。PMN-MDSCs細胞通常表現為FSChiSSChi，于是我們對FSChiSSChi這一群細胞進行了表型分析。我們分別在接種腫瘤細胞后的第15天和第20天對各組小鼠的外周血、脾臟和骨髓中的PMN-MDSCs(CD11b+Gr-1+SSChi)細胞的數量進行了統計分析。第15天時的分析結果表明YVAD給藥能夠顯著增加外周血和脾臟中PMNMDSCs細胞的數量(P值分別為0.009 2和0.004 8)，而對于骨髓中PMN-MDSCs細胞沒有明顯的影響(圖2B-D)。而第20天的結果則顯示YVAD給藥沒有顯著改變荷瘤小鼠各組織中PMNMDSCs的比例(圖2E)。綜上，乳腺癌的發展伴隨著外周血和脾臟中 PMN-MDSCs細胞的積累，而caspase-1的活性能夠調控腫瘤發展早期PMN-MDSCs細胞的發育。

圖1 在種植性原位乳腺癌模型中抑制caspase-1的活性能夠加劇脾腫大并促進腫瘤的生長Fig．1 Inhibition of caspase-1 aggravated splenomegaly and accelerated tumor growth in orthotopic model of breast cancer

2.3 YVAD能增加腫瘤部位MDSCs的比例 伴隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞會釋放一些細胞因子或化學因子而招募多種炎性細胞至腫瘤微環境中[1]。我們運用H＆E染色對不同時間點(10天和15天)的腫瘤組織病理學特征進行了分析。結果顯示，DMSO組和YVAD組中腫瘤組織邊緣部位均有部分炎性細胞的浸潤，并且隨著腫瘤的發展炎性細胞的浸潤程度增加(圖3A)。而腫瘤組織中央部位炎性細胞浸潤數量較少;隨著腫瘤體積的增大，腫瘤組織內部出現了部分壞死區域(圖3B)。以上結果表明，腫瘤的發展伴隨了炎性細胞的浸潤，同時腫瘤中央部位會出現壞死的狀況;然而整體上來看，YVAD給藥對于腫瘤組織中炎性細胞的浸潤情況和細胞壞死情況沒有明顯影響。

為了分析腫瘤組織中MDSCs細胞的數量，我們運用流式細胞技術對于細胞表面特征分子CD11b和Gr-1的表達進行了分析。結果顯示，CD11b和Gr-1雙染后可以將腫瘤微環境中的免疫細胞分為四個亞群;與DMSO組相比，YVAD給藥組中MDSCs(CD11b+Gr-1+)比例明顯增加，由10.2%增加到19.8%，而 CD11b+Gr-1-細胞數量變化不大(圖3C)。對于流式結果統計分析發現，給藥組和對照組中MDSCs的數量具有顯著的差異(圖3D)。這些結果表明caspase-1的活性在MDSCs的發育和積累中發揮負調控的作用。

圖2 YVAD促進外周血和脾臟中PMN-MDSCs細胞的積累Fig．2 YVAD treatment promoted expansion of PMN-MDSCs in peripheral blood and spleen

圖3 YVAD誘導腫瘤組織中CD11b+Gr-1+細胞的積累Fig．3 Accumulation of CD11b+Gr-1+cells in tumor microenvironment induced by YVAD treatment

2.4 YVAD不影響TAMs的招募和分化 TAMs腫瘤微環境中普遍存在的一類非實質細胞，有研究表明M-MDSCs細胞具有分化為TAMs的能力[5]。為了分析MDSCs比例的變化是否會影響TAMs的比例，我們運用CD11b和F4/80雙染的方法檢測了腫瘤組織中TAMs(CD11b+F4/80+)的比例。結果顯示，對照組和YVAD給藥組中TAMs細胞的數量比例分別為8.18%和10.2%。統計學分析流式數據表明，DMSO和YVAD組中TAMs的比例沒有顯著的差異(P=0.54)(圖4A)。我們還運用免疫組化的方法分別檢測了第10天和第15天的腫瘤組織中巨噬細胞(F4/80+)浸潤情況。結果顯示，第15天時TAMs的浸潤明顯比第10天時增多;而YVAD給藥組和DMSO組之間比較，TAMs的浸潤情況并無顯著差異(圖4B)。我們還在體外考察了YVAD對于單核細胞-巨噬細胞分化的調控作用。如圖4C所示，DMSO對照組和YVAD給藥組(25 μmol/L、50 μmol/L)中 F4/80+細胞的比例分別為 68.9%、62.1%和58.7%。對于平均熒光強度的統計學分析結果表明，YVAD給藥對于單核-巨噬細胞的分化過程沒有顯著地調控(圖4D)。因此，YVAD不能調控腫瘤微環境中TAMs的招募和分化。

3 討論

圖4 YVAD對腫瘤組織中TAMs的調控Fig．4 Regulation of TAMs recruitment and differentiation by YVAD treatment

MDSCs是由不成熟的髓細胞(Immature myeloid cells，IMCs)發育形成的，多種細胞亞群組成的抑制性細胞。正常情況下，IMCs細胞能夠遷移到外周器官，并進一步分化成為巨噬細胞、樹突狀細胞或粒細胞。但是在腫瘤、炎癥或感染等病理情形下，微環境中的細胞因子(如 IL-1β、IFN-γ、GM-CSF 等)可以促進MDSCs的招募和活化，同時阻止其分化為成熟的細胞。腫瘤微環境中的MDSCs可以幫助腫瘤細胞逃脫機體的免疫效應，從而促進腫瘤的發展。因此，通過調控MDSCs細胞的發育過程(促進MDSCs的分化或抑制MDSCs的增殖)可以有效激活機體免疫功能，抑制腫瘤生長[2]。

caspase-1能夠通過對一些特異性底物的加工而發揮其生物學功能，其中pro-IL-1β和pro-IL-18是caspase-1最經典的兩種底物。研究發現，caspase-1介導的IL-1β的釋放能夠參與調控多種免疫細胞的發育，如 TH17 細胞和 MDSCs等[14，15]。我們首先證實了caspase-1特異性抑制劑YVAD能夠促進乳腺癌的發展，同時還能加劇脾腫大的程度(圖1D)。基于該現象，我們展開了關于caspase-1調控腫瘤微環境中免疫細胞發育的功能分析。與文獻報道一致[2]，在乳腺癌荷瘤小鼠的外周血、脾臟、骨髓以及腫瘤組織中有大量MDSCs細胞的積累，特別是PMN-MDSCs細胞。YVAD給藥能夠進一步增加外周血、脾臟和腫瘤部位PMN-MDSCs細胞的比例，但是對于骨髓中的PMN-MDSCs細胞影響不大。值得注意的是，在第15天時YVAD給藥組和DMSO對照組比較荷瘤小鼠脾腫大程度有顯著性差異，而在第20天時這兩組間脾腫大程度的差異很小。與此一致，我們發現PMN-MDSCs細胞的比例在第15天時受YVAD給藥的影響較大，而在第20天時YVAD給藥的調控作用則不明顯。這表明caspase-1調控荷瘤小鼠體內免疫細胞發育的效應主要體現在腫瘤發展的早期;而在腫瘤發展的晚期，由于腫瘤細胞壞死導致 caspase-1活性的增強[12]，因而 YVAD效應則被部分抑制。

雖然caspase-1在TH17和MDSCs的細胞發育中發揮了關鍵的調控作用，但是caspase-1對于單核細胞-巨噬細胞的分化卻不是必須的。與野生型小鼠相比，caspase-1-/-小鼠體內巨噬細胞的發育情況并沒有明顯的變化[16]。在腫瘤微環境中，M-MDSCs可以進一步分化TAMs[17]。我們的結果顯示YVAD給藥雖能一定程度減少M-MDSCs的比例(CD11b+Gr-1+SSClow)，但是TAMs比例卻沒有明顯的改變，并且在體外YVAD給藥不能抑制單核-巨噬細胞分化的過程。這表明caspase-1不能調控M-MDSCs的分化為TAMs的過程。Youn等[18]的研究發現，無論在體外還是體內M-MDSCs都具有分化為PMN-MDSCs的能力，而這可能是caspase-1調控MDSCs細胞發育的機制所在。

caspase-1對于腫瘤的調控具有兩面性[15]。一方面，caspase-1通過誘導腫瘤細胞的凋亡或激活機體的獲得性免疫而抑制腫瘤生長;另一方面caspase-1介導IL-1β的釋放能通過促進MDSCs的擴增和活化而促進腫瘤發展。本實驗基于移植性原位乳腺癌小鼠模型，探討了caspase-1對于腫瘤微環境中 MDSCs和 TAMs細胞發育的影響，發現caspase-1可以調控PMN-MDSCs的發育，從而間接影響腫瘤的發展。這些結果不僅拓展了我們對于caspase-1相關生理和病理學功能的認識，而且還為以caspase-1為靶點研發腫瘤治療藥物的探索提供了理論依據。

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