八珍湯對化療后荷瘤小鼠脾T細胞及血清細胞因子的影響①

陳育民 陳曉潔 劉曉霞 王雪玲 陳雪皎 (河北工程大學醫學院，邯鄲056029)

惡性腫瘤是危害人類健康和生命的嚴重疾病之一。目前，化學治療是腫瘤治療中必不可少的手段之一，但單純化療常引起免疫抑制，導致惡性反復感染，機體衰弱，時常出現各種不同程度的毒副反應、預后不良而加速患者的死亡。環磷酰胺(CTX)作為臨床常用的化療藥物，對免疫系統有抑制作用，T細胞也在被抑制之列，而T細胞介導的細胞免疫是抗腫瘤的主力[1]，故化療后腫瘤患者的抗腫瘤能力降低，無法自我徹底清除體內殘存的腫瘤細胞，使其應用受到一定的限制。因此，尋找能夠逆轉化療對T細胞抑制的藥物，將有助于臨床上更好開展化療治療腫瘤。

八珍湯源自《正體類要》，是四君子湯和四物湯的復方。四君子湯能健脾益氣，四物湯可補血養血，八珍湯能匯兩方之功，奏兩方之效，為氣血雙補的經典方。臨床上常用于內科、婦科上的病后失調、久病失治、失血過多等慢性消耗性疾病的治療。近年來，中藥日益受到重視，八珍湯作為中國古方的經典方，其對免疫系統的藥理作用近年來已有報道，但對化療后荷瘤小鼠T細胞亞群和細胞因子的影響還未見報道。故本研究探討了八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞增殖、T細胞亞群及細胞因子的影響，為臨床上輔助治療腫瘤提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及瘤株 健康昆明小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由河北工程大學實驗動物中心提供。S180腫瘤細胞由河北醫科大學第四醫院科研中心饋贈。

1.1.2 藥物 八珍湯(一副)包括:當歸10 g，川芎5 g，白芍 8 g，甘草 5 g，熟地黃 15 g，人參 3 g，白術10 g，茯苓8 g。均購自邯鄲市中醫院中藥房，經河北工程大學醫學院藥理室鑒定。將所有藥材水中浸泡0.5小時，加入大約為藥材體積10倍的水，煮沸1小時，濾出藥液;再加5倍體積的水，煮沸0.5小時，濾出藥液。兩次藥液合并，水浴蒸發至終濃度為2 g生藥/ml的藥液。4℃保存備用。

1.1.3 試劑 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、RPMI1640培養基、ConA為美國Sigma公司產品;PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠CD8均為eBioscience公司產品;小鼠IL-2、IFN-γ ELISA試劑盒為伊萊瑞特生物科技有限公司產品;胎牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、分組及給藥 取腹腔內傳代7天的肉瘤S180小鼠，脫臼處死小鼠，在無菌條件下抽取腹腔內瘤細胞，并以生理鹽水洗滌3次，2 500 r/min離心3分鐘，棄上清液，用無菌生理鹽水調整腫瘤細胞濃度為5×106ml-1，接種于小鼠右腋窩皮下(0.2 ml/只)。接種24小時后隨機分為3組，每組10只，分別為模型組、CTX組、八珍湯+CTX組。另取10只正常小鼠作為正常對照組。正常對照組和模型組腹腔注射生理鹽水0.1 ml/(10 g·d)，連續3天，CTX組和八珍湯+CTX組腹腔注射環磷酰胺(CTX)0.1 ml/(10 g·d)，連續3天。自第4天始，正常對照組、模型組和CTX組用生理鹽水0.2 ml/(10 g·d)灌胃，八珍湯+CTX組用八珍湯0.2 ml/(10 g·d)灌胃，連續10天。末次給藥后2小時進行指標檢測。

1.2.2 MTT法檢測八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞增殖的影響 處死小鼠，無菌取脾，制備脾細胞懸液，臺盼藍計數活細胞在95%以上。用完全RPMI1640培養液將脾細胞懸液調配成細胞濃度2×106ml-1的單細胞懸液。取已制備的脾細胞懸液加入96孔培養板中，100 μl/孔，每個樣本做6個孔。其中3孔加ConA液(0.1 mg/ml)100 μl，使其終濃度為5 μg/ml，另3孔作為對照。置 37℃、5%CO2培養箱中培養72小時。于實驗終止前每孔加入5 g/L MTT 20 μl，振蕩器上振蕩10分鐘，繼續培養4小時。培養結束后，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10分鐘，使紫色結晶完全溶解。用酶標儀于570 nm波長測定A值。細胞增殖率=(實驗組平均A值 /對照組平均A值)×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞亞群的影響 取100 μl已制備的脾淋巴細胞懸液于EP管中，4℃、1 500 r/min離心5分鐘，加入冷 PBS 1 ml，離心，棄上清，加冷凍 PBS 100 μl，并按說明加入 PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠 CD8，4℃避光孵育30分鐘，加入 PBS1 ml，離心，棄上清，加入 500 μl PBS，流式細胞儀檢測。

1.2.4 ELISA檢測八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響 末次給藥后2小時，各組小鼠球后靜脈叢采血，每只取血0.8～1 ml，分離血清，并嚴格按照試劑盒說明進行操作。實驗組均設3個復孔。將每個標準品及標本的OD值減去空白孔的OD值，繪制標準曲線，以標準品濃度作為橫坐標，OD值為縱坐標，以平滑曲線連接各標準品的坐標點，通過標本的OD值在曲線上查出其對應濃度。IL-2/IFN-γ(μg/L)=標準曲線上查出的濃度×稀釋倍數。

1.3 統計學分析 應用SPSS11.5軟件對所有數據進行統計學處理，結果以±s表示，兩組間均數比較用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞增殖的影響

用MTT法檢測各組T細胞經ConA刺激72小時后的增殖能力，由圖1可見各組荷瘤小鼠的T細胞增殖能力顯著低于正常對照組(P＜0.01)，CTX組T細胞增殖能力明顯低于模型組(P＜0.01)，八珍湯+CTX組T細胞增殖能力明顯高于CTX組(P＜0.01)，與模型組相比沒有顯著性差異，但有增高趨勢(P＞0.05)。

表1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞亞群的影響(±s，%)Tab．1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s，%)

表1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞亞群的影響(±s，%)Tab．1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s，%)

Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01;compared with model group，3)P ＜0.05;compared with CTX group，4)P ＜0.01.

7±4.29 1.59±5.06 Model 10 40.21±4.711) 23.89±6.321) 12.51±3.651) 1.82±3.271)CTX 10 24.26±7.281)2) 15.60±4.931)2) 7.46±3.011)2) 1.92±2.351)Bazhen decoction+CTX 10 34.93±4.241)3)4) 19.46±5.041)3)4) 10.48±4.841)3)4) 1.79±4.831)CD4/CD8 Normal control 10 47.43±7.08 28.25±3.12 17.1 Groups n CD3+T CD3+CD4+T CD3+CD8+T

圖1 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞增殖能力的影響Fig．1 Effect of Bazhen decottion on proliferation of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy

2.2 八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞亞群的影響由表1可見，各荷瘤小鼠組的T細胞亞群明顯低于正常對照組(P＜0.01)，而CD4/CD8比值明顯高于正常對照組(P＜0.01)。CTX組的T細胞亞群與模型組相比顯著降低(P＜0.01)。八珍湯+CTX組的T細胞亞群明顯高于CTX組(P＜0.01)，但仍低于模型組(P＜0.05)。各荷瘤小鼠組CD4/CD8比值均無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響 ELISA測得各組小鼠血清細胞因子的結果如表2所示:各荷瘤小鼠組血清中IFN-γ、IL-2的含量明顯低于正常對照組(P＜0.01)，CTX組荷瘤小鼠血清中 IFN-γ、IL-2含量明顯低于模型組(P＜0.01)，八珍湯+CTX組小鼠血清IFN-γ、IL-2含量明顯高于CTX組(P＜0.01)，而與模型組無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響(μg/L，±s)Tab．2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L，±s)

表2 八珍湯對化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響(μg/L，±s)Tab．2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L，±s)

Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01;compared with CTX group，3)P＜0.01.

Groups n IFN-γIL-2 Normal control 10 10.276±6.953 9.841±2.618 Model 10 7.702±7.0161) 6.914±3.9081)CTX 10 4.260±3.5621)2) 4.012 1±5.2831)2)Bazhen decoction+CTX 10 7.329±3.7081)3) 7.025±2.9671)3)

3 討論

腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病，目前除手術外，化學療法是治療腫瘤的主要手段，但它在殺滅腫瘤細胞的同時，也會殺傷正常細胞，對機體的免疫功能全面抑制，使機體免疫功能低下。而T細胞介導的細胞免疫功能低下在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。故機體T細胞的狀況能夠反映機體抗腫瘤的能力。因此如何提高化療后機體T細胞功能是腫瘤治療的一個重要內容。

國內已將中草藥用于防治化療毒副作用方面[2-4]。八珍湯源自《正體類要》，是四君子湯和四物湯的復方。四君子湯能健脾益氣，四物湯可補血養血，八珍湯能匯兩方之功，奏兩方之效，為氣血雙補的經典方。臨床上常用于內科、婦科上的病后失調、久病失治、失血過多等慢性消耗性疾病的治療。本課題組之前的研究發現八珍湯能夠解除TGF-β1對T細胞增殖和活化的抑制作用[5]。本文從下述指標觀察了八珍湯對化療后荷瘤小鼠T細胞及細胞因子的影響。

在體外研究中，T細胞經特異性抗原或非特異性抗原，如ConA等的誘導，會發生轉化增殖。因此，常將T細胞的增殖反應作為評價T細胞功能，反映機體免疫狀況的指標[6]。T細胞按表面CD分子的不同分為CD4+T細胞和CD8+T細胞，參與抗腫瘤免疫的主要是CD8+T細胞介導的細胞免疫，故T細胞亞群是反映機體抗腫瘤能力的一個常用指標。IFN-γ是活化的T細胞產生的一種具有多潛能的細胞因子，對免疫系統具有重要的調節作用，它可以激活巨噬細胞，促進MHC分子表達和抗原提呈，誘導Th1細胞分化，抑制Th2細胞分化，從而促進細胞免疫功能[7]。IL-2主要由活化的細胞產生，是調節機體免疫功能最主要的細胞因子之一。它能刺激T細胞的生長和分化，激活NK細胞和巨噬細胞，促進CTL細胞的功能。故IFN-γ和IL-2不僅能反映T細胞的功能，而且在一定程度上也能反映機體的免疫水平，在腫瘤治療中發揮重要作用[8]。

本實驗結果顯示:八珍湯能夠促進T細胞增殖，提高CD4+T細胞和CD8+T細胞比例，特別是CD8+T細胞比例，促進T細胞分泌IFN-γ和IL-2。故可知八珍湯可促進T細胞功能，提高機體細胞免疫能力。

因此，本研究為臨床上將八珍湯用于改善化療所致機體免疫功能低下提供了理論依據。但有關八珍湯的給藥時間、用藥時間長短等問題需要進一步探討。

1 金伯泉.醫學免疫學[M].第5版.北京:人民衛生出版社，2008;214-215.

2 胡志明，邱錫謙，曾玉芬.扶正排毒通腸湯治療惡性腫瘤化療毒副作用60例[J].江西中醫藥，2011;42(338):25-26.

3 古紅莉.參麥注射液減輕惡性腫瘤化療毒副作用60例臨床觀察[J].新中醫，2008;40(10):20-21.

4 邵青偉，葛 熙.參芪扶正液預防癌癥化療所致毒副作用的觀察與護理[J].實用臨床醫藥雜志，2010;14(10):17-18.

5 劉曉霞，陳劍華，陳育民et al.八珍湯對TGF-β1抑制的T淋巴細胞增殖及其活化影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2009;25(11):1053-1055.

6 呂世靜.臨床免疫學檢驗[M].第2版.北京:中國醫藥科技出版社，2010;165-166

7 金伯泉.醫學免疫學[M].第5版.北京:人民衛生出版社，2008;60-61.

8 金伯泉.醫學免疫學[M].第5版.北京:人民衛生出版社，2008;252-253.