Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在結(jié)核病人外周血中的變化及臨床意義

王國戧 趙英政 裴利宏 婁婷葉 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，衛(wèi)輝453100)

天然CD4+T細(xì)胞在不同細(xì)胞因子環(huán)境中激活可分化為4類不同的 T細(xì)胞亞群，即:Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié) T細(xì)胞(Tregs)是新發(fā)現(xiàn)的兩類不同于Th1型和Th2型的CD4+T細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-6及腫瘤壞死因子(Tumornecrosis factor，TNF)-α、IL-21、IL-22、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，而不分泌IFN-γ和IL-4為特征的CD4+T細(xì)胞。Th17細(xì)胞被認(rèn)為是一類重要的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及自身免疫的細(xì)胞[1]，在自身免疫性疾病、抗胞外菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥及腫瘤等過程中發(fā)揮重要作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)是一類特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的CD4+T細(xì)胞，可通過細(xì)胞間接觸抑制及分泌抑制性細(xì)胞因子(如lL-10、TGF-β)等途徑發(fā)揮抗炎和維持自身免疫耐受的作用。Th17細(xì)胞同Treg細(xì)胞密切相關(guān)，都是從天然CD4+T細(xì)胞分化而來，在發(fā)育和功能上既相互聯(lián)系，又相互牽制[2]。Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道的比較多，而關(guān)于其在結(jié)核性疾病中的作用國內(nèi)外報(bào)道還很少，且所持觀點(diǎn)也不一致[3-5]。為此，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，同時(shí)檢測Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在結(jié)核病患者和健康對(duì)照者外周血中的表達(dá)，分析并比較外周血中Th17/Treg細(xì)胞變化，探討Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在結(jié)核病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本研究所用標(biāo)本均來自我院結(jié)核病區(qū)2011年6月至2012年12月初次來我院門診就醫(yī)的患者，尚未進(jìn)行藥物治療。其中健康對(duì)照組34例，平均年齡(33.6±8.7)歲，男性24例，女性10例;空洞型肺結(jié)核病人21例，平均年齡(35±6.9)歲，男性16例，女性5例;浸潤性肺結(jié)核29例，平均年齡(31±8.8)歲，男性21例，女性8例;結(jié)核性胸膜炎25例，平均年齡(30±7.8)歲，男性19例，女性6例，以上各型結(jié)核病均符合中國結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)入選的結(jié)核病人均排除了其他病原體的感染，并且排除了患有自身免疫性疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將上述人群分為四組:第一組，健康對(duì)照組;第二組，空洞型肺結(jié)核病人組;第三組，浸潤性肺結(jié)核病人組;第四組，結(jié)核性胸膜炎病人組。采集上述四組人群的外周靜脈血，分別檢測Th17免疫細(xì)胞和Treg免疫細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)率以及Th17免疫細(xì)胞/Treg免疫細(xì)胞的比值，各項(xiàng)操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，具體操作簡略如下。

1.2.1 Th17細(xì)胞的檢測 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的提取:所有檢測對(duì)象均空腹抽取肘靜脈血，EDTA抗凝，按常規(guī)方法分離PBMC。(1)細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的RPMI1640重懸提取的PBMC;取20 μl細(xì)胞懸液加20 μl錐蟲藍(lán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106ml-1;加入PMA(終濃度為100 ng/ml)和離子霉素(終濃度1 μg/ml)并充分混勻，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)后加入莫能霉素(終濃度為1 μg/ml)混勻后繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。(2)熒光標(biāo)記CD3+CD4+IL-17+Th17細(xì)胞:取刺激培養(yǎng)后細(xì)胞懸液100 μl于流式管中，每管加0.5 ml固定液，振蕩搖勻后室溫孵育20分鐘;加2 ml破膜洗液，振蕩搖勻后室溫孵育20分鐘，離心后棄上清;破膜洗液洗滌和重懸細(xì)胞，加入10 μl抗人 IL-17Alexa Fluor647/CD3 FITC/CD4 PE抗體混勻后室溫暗處孵育30分鐘;陰性對(duì)照管則加入抗人IL-17同型對(duì)照IgG1/CD3 FITC/CD4 PE;0.5小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 Treg細(xì)胞的檢測 用PBS重懸提取的PBMC;取20 μl細(xì)胞懸液加20 μl錐蟲藍(lán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106ml-1;加入1 ml Foxp3固定/透膜液，充分混勻后室溫孵育20分鐘;洗滌及1 ml Foxp3透膜緩沖液重懸細(xì)胞，暗處孵育15分鐘;加入10 μl抗人Foxp3 Alexa Fluor488/CD25 PE/CD4 PerCP抗體混勻后暗處孵育30分鐘;0.5小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 外周血Th17和Treg細(xì)胞的表達(dá)情況 三組結(jié)核病人的Th17細(xì)胞在外周血的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組人群(P＜0.05，分別為 0.009、0.003、0.000)，另外，三組結(jié)核病人之間Th17細(xì)胞的比較情況:空洞型肺結(jié)核病人組vs浸潤性肺結(jié)核病人組(P=0.852)，空洞型肺結(jié)核病人組vs結(jié)核性胸膜炎病人組(P=0.670)，浸潤性肺結(jié)核病人組vs結(jié)核性胸膜炎病人組(P=0.806)。健康對(duì)照組人群的Treg細(xì)胞在外周血的表達(dá)顯著高于三組結(jié)核病人(P ＜0.05，分別為 0.016、0.000、0.000)，三組結(jié)核病人之間Treg細(xì)胞的比較情況:空洞型肺結(jié)核病人組vs浸潤性肺結(jié)核病人組(P=0.097)，空洞型肺結(jié)核病人組vs結(jié)核性胸膜炎病人組(P=0.253)，浸潤性肺結(jié)核病人組vs結(jié)核性胸膜炎病人組(P=0.544)。健康對(duì)照組人群外周血的Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值顯著低于三組結(jié)核病人的Th17/Treg比值(P ＜0.05，分別為 0.005、0.000、0.000)，同樣三組結(jié)核病人的Th17/Treg值之間沒有顯著差異(P ＞0.05，分別為 0.332、0.195、0.759)，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在不同組別人群外周血中的表達(dá)情況(%)見表1和流式細(xì)胞圖，見圖1、2;4組人群的Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在外周血細(xì)胞比率數(shù)據(jù)分布和4組人群的Th17/Treg比值數(shù)據(jù)分布趨勢見圖3～5。

2.2 4組人群Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間的相關(guān)性結(jié)核性胸膜炎病人外周血Th17細(xì)胞的表達(dá)與其Treg細(xì)胞在外周血的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.684，P=0.000＜0.05)，另兩組結(jié)核病人及健康對(duì)照組人群外周血Th17細(xì)胞的表達(dá)與其Treg細(xì)胞在外周血的表達(dá)沒有明顯相關(guān)性(P＞0.05)，但也顯示負(fù)相關(guān)趨勢，詳見表2。

表1 Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在不同組別人群外周血中的表達(dá)情況(%)Tab．1 Expression of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood of different groups(%)

圖1 各檢測組Th17細(xì)胞流式圖Fig．1 Flow cytometry pictures of Th17 cells among four groups

圖2 各檢測組Treg細(xì)胞流式圖Fig．2 Flow cytometry pictures of Treg cells among four groups

圖3 4組檢測人群Th17細(xì)胞表達(dá)率的分布Fig．3 The expression ratio of Th17 in four groups

圖4 4組檢測人群Treg細(xì)胞表達(dá)率的分布Fig．4 The expression ratio of Treg in four groups

表2 4組人群Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間的相關(guān)性Tab．2 The correlation between Th17 and Treg cells from four groups

3 討論

圖5 4組檢測人群Th17/Treg細(xì)胞比值的分布Fig．5 The ratio of Th17 to Treg in four groups

關(guān)于結(jié)核病的免疫保護(hù)機(jī)制目前認(rèn)為Th1細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子(IFN-γ)在結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)中的作用是非常重要的[3，6]，但是僅有 Th1細(xì)胞參與的免疫保護(hù)是不夠的，其他免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與對(duì)于抗結(jié)核免疫也非常重要[3，7，8]。Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種免疫細(xì)胞，它是不同于Th1和Th2免疫細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群，具有強(qiáng)大的促炎作用[9]。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞有著密切的聯(lián)系，二者在功能上互相拮抗，而在分化過程中卻具有相關(guān)性，其數(shù)量及功能的異常可導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。目前關(guān)于Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的研究多集中在自身免疫性疾病，在結(jié)核病中的作用還不清楚[10，11]，為此我們的研究小組設(shè)計(jì)了本項(xiàng)研究，以探討Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在結(jié)核病中的作用。

本研究結(jié)果顯示健康對(duì)照組人群外周血Th17細(xì)胞的表達(dá)率明顯低于空洞型肺結(jié)核病人組、浸潤性肺結(jié)核病人組和結(jié)核性胸膜炎病人組的Th17細(xì)胞表達(dá)率，而三組病人的Treg細(xì)胞在外周血的表達(dá)率卻明顯低于健康對(duì)照組，三組病人的Th17/Treg比值顯著高于健康對(duì)照組，這說明Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞與結(jié)核病免疫的病理反應(yīng)密切相關(guān)。Th17細(xì)胞具有強(qiáng)大的促炎作用，本研究結(jié)果支持了這一點(diǎn)。病人組的Th17細(xì)胞顯著高于健康對(duì)照組，這可能是過度表達(dá)的Th17細(xì)胞分泌了過多的炎癥因子(如IL-17)，加重了病變部位的病理性損害。資料顯示Th17細(xì)胞表達(dá)率與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，并且可以作為臨床結(jié)果的觀察指標(biāo)[12]。Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞功能上相互拮抗，誘導(dǎo)免疫耐受，在本研究中病人Treg細(xì)胞比率與健康對(duì)照組相比顯著降低，導(dǎo)致了Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例失衡，過強(qiáng)的免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致了結(jié)核病的免疫病理損害，但更詳細(xì)的免疫損害機(jī)理須進(jìn)一步研究。在病毒性感染性疾病中Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例失衡在免疫病理損害中起了重要的作用[13，14]，本研究結(jié)果支持 Th17 細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例失衡導(dǎo)致免疫病理損害的觀點(diǎn)，在結(jié)核病人中Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例失衡可能對(duì)結(jié)核病的病理損害也起到了重要作用。

關(guān)于Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在結(jié)核病人中所起的作用，目前國內(nèi)外報(bào)道的非常少，且現(xiàn)有的少量報(bào)道多集中在結(jié)核疫苗所引起的Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化[4，8，10，15，16]，并且這些少量報(bào)道所持的結(jié)論也不一致，有研究認(rèn)為Th17細(xì)胞的過量表達(dá)和結(jié)核的免疫發(fā)病機(jī)理相關(guān)[5]，且和嚴(yán)重程度相關(guān)[7]。也有相反的報(bào)道，認(rèn)為活動(dòng)性結(jié)核Th17細(xì)胞的表達(dá)量顯著低于健康人[3]，并且隨著抗結(jié)核的治療時(shí)間的推移，Th17細(xì)胞逐漸增加，Treg細(xì)胞逐漸降低[17]。也有報(bào)道不支持Th17細(xì)胞分泌的IL-17因子參與結(jié)核的免疫病理損害[4]。本研究結(jié)果認(rèn)為，結(jié)核病人的Th17細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于健康人，Treg細(xì)胞顯著低于健康人，這種Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例的失衡，這種免疫失衡導(dǎo)致了免疫過強(qiáng)，可能與結(jié)核病人的免疫病理損害有關(guān)，因此，本文認(rèn)為Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例的失衡對(duì)結(jié)核的免疫病理損害起到了重要作用，本文的觀點(diǎn)相對(duì)傾向于Th17細(xì)胞的過量表達(dá)和結(jié)核的免疫發(fā)病機(jī)理相關(guān)，并且與嚴(yán)重程度相關(guān)。但是，是何種機(jī)制導(dǎo)致了結(jié)核病人的Th17細(xì)胞增加和Treg細(xì)胞的減少，筆者沒有檢索到相關(guān)文獻(xiàn)，筆者個(gè)人認(rèn)為，可能是結(jié)核菌感染后，刺激機(jī)體的天然免疫應(yīng)答，比如巨噬細(xì)胞吞噬病菌后由靜止?fàn)顟B(tài)活化，分泌一些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子刺激Th17細(xì)胞增殖，再者吞噬細(xì)胞吞噬病菌后，將細(xì)菌的抗原呈遞給某些免疫細(xì)胞引起一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致Th17細(xì)胞升高，當(dāng)然這都是推測，還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文也存在這一些不足，沒有對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行同步檢測，本研究小組在后續(xù)的研究中將同步進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞因子的檢測，做一些基礎(chǔ)方面的研究，并擴(kuò)大病人量，使研究結(jié)果更具權(quán)威性。

綜上所述，本研究認(rèn)為Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例的失衡，和結(jié)核病人的免疫病理損害顯著相關(guān)，Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例的失衡對(duì)結(jié)核的發(fā)病起到了重要作用。

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