EPO光激化學發光定量檢測方法的建立①

陳 凱 吳 丹 聶慶東 相 平 任 杰 李會強

(天津醫科大學醫學檢驗學院免疫學教研室，天津300140)

促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種調控紅細胞生成的糖蛋白激素，主要由腎臟近曲小管附近的細胞合成和分泌，能刺激骨髓紅細胞的生成和釋放，從而調節紅系祖細胞存活、增殖、分化及成熟的造血因子，具有維持外周血中紅細胞、血紅蛋白恒定的作用，血液中EPO的水平能反映機體紅細胞生成的能力。因此測定血液病貧血患者血清中EPO水平，對了解各類貧血的發病機制有一定價值，同時可為患者糾正貧血癥狀提供依據。目前檢測EPO的方法有酶聯免疫、放射免疫及化學發光免疫等，作為近年興起的新型定量免疫學檢測技術，光激化學發光免疫分析(Light initiated chemiluminescence assay，LiCA)技術，其具有靈敏度高、時間分辨能力強、線性范圍寬、背景熒光低、免洗板、性質穩定、快速簡便、易于微型化自動化等優點，代表了現在及未來分析檢測技術的發展趨勢。本研究利用發光微粒和感光微粒兩種核心物質的光特性，建立了一種新的快速定量檢測血漿EPO濃度的雙抗體夾心模式的LiCA方法，并對該法的重復性、敏感性、抗干擾性及回收率等指標進行了評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 陽性血清標本51例來自中國醫學科學院血液學研究所血液病醫院，采用由北京東亞免疫技術研究所提供的EPO放射免疫分析試劑盒檢測。100例正常人血清來源于天津市北辰醫院身體健康、無貧血指標異常的體檢人群，均經過血常規檢查，紅細胞及血紅蛋白均無異常，其中男性47例，女性53例，年齡22～65歲，平均(44±11)歲，紅細胞(4.55±0.6)×1012L-1，血紅蛋白(131±20)g/L。

1.1.2 材料和儀器 LiCA通用液[鏈霉親和素(SA)包被的感光微粒]及發光微粒購自上海博陽生物有限公司。三株EPO抗體及EPO標準品(30 ng/ml)由天津沃克生物科技有限公司提供。96孔微孔板及LiCA HT熒光檢測儀為上海博陽公司提供。

1.2 方法

1.2.1 抗體包被發光微粒 依據博陽7 000系列微球包被程序，通過發光微粒懸液處理，抗體透析，混合，反應，封閉，清洗幾個步驟，將抗體共價結合于發光微粒。

1.2.2 抗體與生物素連接 抗體的準備:將抗體置于0.1 mol/L 緩沖液(0.1 mol/L、Na2CO3/NaHCO3，pH9.5)中充分透析，其間換液數次，測抗體濃度，調濃度至1 mg/ml。按摩爾比5∶1混合生物素和抗體，室溫攪拌反應1小時。在4℃下用0.1 mol/L PBS(pH7.4)溶液透析24小時，其間換液數次，充分去除未結合的生物素。

1.2.3 雙抗體夾心模式LiCA檢測步驟 將25 μl標準品/待測血漿標本分別加到相應反應孔內，每個標本重復測定2次;每孔加入25 μl的發光微?？贵w;每孔加入25 μl的生物素化抗體;把已加好的反應板放入LiCA儀中，37℃振動孵育30分鐘;每孔加入LiCA通用液(鏈霉親和素化感光微球)175 μl，再孵育15分鐘;讀取光信號值(孵育和檢測均在LiCA HT自動完成)。

1.2.4 標準品的制備 用標準品緩沖液將EPO標準液配制成 0、0.03、0.3、3、15 及 30 ng/ml的系列濃度，4℃保存備用。

1.2.5 三種抗體的篩選 1、2、3號抗體分別進行發光微粒包被及生物素化，將標記抗體的發光微粒1∶100稀釋，將生物素化EPO抗體1∶1 000稀釋，檢測EPO 0 ng/ml及30 ng/ml標準品，每個濃度重復測定2次，采用棋盤格滴定法，通過LiCA檢測儀進行檢測，并得出光信號值及信噪比，根據較高信號值及信噪比篩選出雙抗體組合。

1.2.6 最佳反應濃度的篩選過程 選用1∶100、1∶200、1∶300的1號抗體標記的發光微粒分別與1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000 的 2 號生物素化抗體進行組合，然后對濃度為0 ng/ml、30 ng/ml的標準品進行檢測，每個濃度重復2次，采用棋盤格滴定法，通過LiCA檢測儀進行檢測，并得出光信號值及信噪比，根據較高信號值及信噪比篩選出最佳反應濃度。

1.2.7 檢測方法的性能驗證

1.2.7.1 標準曲線的建立 以標準品濃度為橫坐標，信號值為縱坐標，通過ELISA Calc軟件進行雙對數函數轉換模式的擬合處理，建立標準曲線。

1.2.7.2 靈敏度 以零參考標準品當作樣品測量15次，計算其均值及標準差。以其測定值的均值加上2倍的標準差所得信號值為檢測信號值，由標準曲線得出的濃度，即為其靈敏度[1]。

1.2.7.3 精密度 取3個濃度血清質控品進行測定，各設10個復孔，計算各質控品檢測值的均數、標準差及CV值，為分析內精密度;對3個濃度血清質控品連續檢測15天，各設1復孔，計算各質控品檢測值的均數、標準差及CV值，為分析間精密度[2]。1.2.7.4 添加回收試驗 回收率取2份質控血清(即已知濃度的標準血清)，分別加入3份不同濃度的標準品(即樣品濃度)，測回收率?；厥章?(實際濃度/理論濃度)×100%。

1.2.7.5 干擾試驗 檢測本實驗研發的光激化學發光免疫分析方法在干擾性物質(溶血、高血脂、高膽紅素)存在的情況下檢測標本的準確性。我們對已知濃度的樣本加入血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素進行測定，計算回收率。

1.2.7.6 Hook效應 將參考標準品抗原稀釋成不同濃度進行測定。

1.2.7.7 方法學比較 同時用研發的雙抗體夾心光激化學發光方法及放射免疫分析方法檢測正常及高值EPO標本各51份，并進行相關性分析。

1.2.7.8 正常參考值范圍 用我們建立的光激化學發光方法檢測100份健康人血清，統計血清EPO水平的分布情況。數據采用統計軟件SPSS19.0進行處理。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件和ELISA Calc對結果進行統計分析，所有數據進行正態性檢驗，服從正態性分布的計量資料采用±s表示，采用pearson檢驗進行相關分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義，P＜0.01為差異具有顯著性意義。

2 結果

2.1 確定最佳雙抗體組合 1、2、3號抗體分別進行發光微粒包被及生物素化，按經驗將標記抗體的發光微粒1∶100稀釋，將生物素化EPO抗體1∶1 000稀釋，檢測EPO 0 ng/ml及30 ng/ml標準品，每個濃度重復測定2次，采用棋盤格滴定法，通過LiCA檢測儀進行檢測，根據信號值、信噪比(S/N)值，得出1號抗體標記發光微粒和2號抗體標記生物素為最佳組合，其信號值及信噪比最高。結果見表1。

表1 抗體標記發光微粒與生物素化抗體配對結果(平均值)Tab．1 The result of combination between antibody-labeled light emitting particles and biotinylated antibody(Mean)

2.2 確定最佳反應濃度 根據經驗我們選用1∶100、1∶200、1∶300 的 1 號抗體標記的發光微粒分別與 1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000 的 2 號生物素化抗體進行組合，然后對濃度為0 ng/ml、30 ng/ml的標準品進行檢測，每個濃度重復2次，采用棋盤格滴定法，通過LiCA檢測儀進行檢測，根據其信號值和信噪比(S/N)值。得出1號抗體標記的發光微粒濃度為1∶100和2號抗體標記的生物素濃度為1∶1 000為最適反應濃度，結果(平均值)見表2。

2.3 標準曲線的建立 用小牛血清作為稀釋液倍比稀釋 EPO 標準品(30 ng/ml)，濃度為 1、5、10、15以及30 ng/ml，濃度的常用對數(lgN)作為橫坐標，光信號的常用對數(lgG)作為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1，線性方程為 y=1.144 x+3.156;r2=0.998 16。

2.4 靈敏度 以“0”標準品當作樣品測量15次，計算其均值及標準差。以其測定值的均值加上2倍的標準差所得信號值為檢測信號值，由標準曲線方程，得出(雙抗夾心法)光激化學發光法檢測EPO的靈敏度為0.09 ng/ml。

2.5 精密度 用含3、10、30 ng/ml EPO抗原的溶液各測定10個復孔，其批內變異系數(CV)分別為2.71%、2.10%和3.79%。對三個水平EPO抗原的溶液，連續測定15天，其批間CV分別是3.26%、3.11%和4.05%，批內平均變異系數為2.93%，批間平均變異系數為3.86%，結果見表3。

表2 1號抗體標記發光微粒及2號抗體標記生物素濃度配比信號值Tab．2 The concentration ratio signal value of No．1 antibody-labeled light emitting particles and No．2 biotinylated antibody

2.6 添加回收試驗 將EPO抗原濃度為30 ng/ml和15 ng/ml的標準品，分別與 EPO濃度為10 ng/ml、3 ng/ml的標本按體積比為 1∶9 混合，通過LiCA法測得混合后樣本的濃度，計算測定值與理論值的比值，從而得出其回收率，見表4、5。

2.7 干擾試驗 準備無溶血、脂血及黃疸的新鮮混合血漿樣本，EPO濃度為13.29 ng/ml。按體積1∶1比例分別加入高濃度的血紅蛋白(Hb)、甘油三酯(日常工作時預留)、總膽紅素(日常工作時預留)的干擾血漿，從而獲得干擾樣品，用同樣的方法加入等量的去離子水作為對照樣品，每個樣品按照隨機次序測定10次，取干擾樣品和對照樣品各自測定值的均數計算百分比(干擾樣品測定值/對照樣品測定值×100%)，以＜90%和＞110%作為判斷干擾具有臨床意義的標準，在干擾物溶血標本血漿血紅蛋白＜20 g/L;脂血標本甘油三酯＜10 mmol/L;黃疸標本總膽紅素＜200 μmol/L時，檢測結果均不受干擾。結果見表6。

圖1 雙抗體夾心光激化學發光檢測EPO標準曲線Fig．1 The standard curve of double-antibody sandwich LiCA detect EPO

表3 雙抗體夾心光激化學發光精密度Tab．3 The precision of double-antibody sandwich LiCA

2.8 Hook效應 用BASE稀釋EPO標準品，濃度為 1、3、5、7.5、10、15、25、30(ng/ml)共 8 個濃度值，每個濃度樣品重復測定4次，計算各濃度值測定值的均數，本檢測方法在EPO濃度為0～30 ng/ml內未見Hook效應(見圖2)。

2.9 方法學比較 同時用研發的雙抗體夾心光激化學發光方法及放射免疫分析方法檢測正常及高值EPO標本各 51份，兩種檢測結果相比較，用SPSS19.0進行線性相關分析，結果(圖3)顯示兩種方法在0.01(雙側)水平顯著相關，r=0.957。

2.10 正常參考值范圍 用我們建立的雙抗體夾心光激化學發光方法檢測100份正常人血標本，來源于身體健康，無貧血指標的體檢人群，其中男性47人，女性53人，每份樣品進行雙孔測定，數據采用統計軟件SPSS 19.0進行處理。統計血清EPO水平的分布情況，計算均數及標準差，這100人份的EPO濃度值經正態性檢驗為正態分布，均值為3.78 ng/ml，標準差為1.54。醫學參考值范圍的制定通常采用百分位數法，以2.5～97.5百分位值作為參考值范圍。雙抗體夾心光激化學發光法檢測EPO參考值范圍:為0.76～6.80 ng/ml。

表4 回收系列樣品的配制Tab．4 The preparation of recovery test sample

表5 回收實驗結果Tab．5 The result of recovery test

表6 血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾實驗結果Tab．6 The interference test result of hemoglobin，triglycerides and bilirubin

圖2 雙抗體夾心模式LiCA Hook實驗檢測信號值Fig．2 The Hook experiment signal value of double-antibody sandwich LiCA

圖3 兩種方法檢測EPO相關性分析Fig．3 Correlation of two detect EPO methods

3 討論

促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是最早發現并運用于臨床的造血生長因子之一。在成人體內，EPO絕大部分由腎臟產生，少量來自肝臟(胎兒及新生兒則主要依靠肝臟產生)。機體缺氧是腎臟分泌EPO的基本動力，腎臟通過相應細胞(腎皮質細胞等)感受機體血氧濃度的變化，對EPO的產生進行調控，從而參與紅細胞的生成過程。一旦機體表現缺氧(由貧血、血容量減少等引起)，腎臟即分泌大量的EPO進入血液，隨血液循環到達骨髓，作用于造血干細胞，促使紅細胞增生，直到紅細胞的攜氧量達到機體正常水平。作為促使造血干細胞分化的重要成分，對于紅細胞生成有著決定性的作用[3]。臨床上EPO的檢測主要是通過測定血清或尿樣中EPO的含量，分析機體內EPO水平，借此判斷貧血程度及貧血原因。

本研究采用的LiCA技術[4]是一種通過化學發光檢測微球間的結合，進而檢測分析物含量的方法。在680 nm的激發光照射下，感光微球中的光敏物質受到激發產生單線態氧，單線態氧擴散至發光微粒，與其中的發光物質反應，即產生化學發光。由于單線態氧在溶液中維持活性的時間很短(約4 μs)，只有那些通過待測物連接在一起的發光微粒和感光微球才能產生化學發光。納米級的微球增加了反應表面積，極大地提高了檢測靈敏度;恰當的熒光波長及時間分辨計數模式，有效提高了信噪比，增加了反應的特異性。本研究通過生物素化EPO抗體與待測樣本中的EPO及抗EPO抗體包被的發光微粒以雙抗體夾心模式結合，再與鏈霉親和素結合的感光微球共同組成反應體系，在激發光照射下產生單線氧的能量轉移，從而產生化學發光，待測樣本的EPO濃度與發光強度呈正相關。該方法檢測EPO的靈敏度較低為0.09 ng/ml;批內變異系數和批間變異系數分別為2.93%和3.86%;此外我們檢測51例EPO增高及51例健康體檢者EPO的結果與目前常用的放射免疫法檢測EPO結果比較具有良好的相關性(r=0.957)，本檢測方法的參考范圍為0.76～6.80 ng/ml。此外，本方法操作步驟簡單方便，具有較好的抗干擾性、較寬的線性范圍(0.09～30 ng/ml)，EPO濃度高達30 ng/ml時無Hook效應，是一種實用可靠的檢測方法。目前，本研究完成了雙抗體夾心模式光激化學發光EPO檢測方法的建立及方法學評價，對于臨床上的應用價值還有待對大量臨床標本檢測結果進行分析及驗證。

1 馮仁豐.分析靈敏度(檢測限)[J].上海醫學檢驗雜志，2002;17(5):133-136.

2 黃 穎.標記免疫分析的質量控制和標準化[J].標記免疫分析與臨床，2006;13(4):240-243.

3 姑麗鮮·熱依木，夏木西卡馬爾·買買提明，田剛.促紅細胞生成素在臨床中的應用[J].檢驗醫學與臨床，2009;6(24):2157-2158.

4 高云朝.光激化學發光技術研究進展與應用[J].中華檢驗醫學雜志，2009;32(4):474-476.