E2F1基因敲除小鼠骨髓造血干、祖細胞減少

石桂英，葛文平，張連峰，白 琳

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

細胞內重要的轉錄因子E2F1是E2F家族中第一個被克隆出來的蛋白，對細胞的增殖、分化和凋亡都發揮著關鍵性的作用。E2F1參與了細胞周期從G1期到S期的轉換:在細胞周期G1期前，Rb與E2F1結合限制了其活性，當細胞周期蛋白激酶CDK結合蛋白Rb后，磷酸化的Rb釋放E2F1/DP-1復合物，這樣E2F1/DP-1就結合到基因組上，發揮轉錄調控功能激活下游基因，進而使細胞周期從G1期轉換到 S 期［1，2］。同時，E2F1 還發揮促凋亡功能，通過p53依賴型以及p53非依賴型兩種細胞信號通路，進而激活下游促凋亡蛋白如:Bcl-2、homology3(BH3)-only proteins PUMA、Noxa、Bim、Hrk/DP5、Bik 以及 caspase-3、-9 等［3－6］;此外，E2F1還抑制細胞存活信號通路分子如:NF-κB、Mcl-1等［7，8］。通過E2F1這兩方面的作用，最終帶來細胞的凋亡。

已有研究發現，E2F1基因敲除小鼠胸腺增大，進一步研究發現，其機制是E2F1基因敲除后抑制成熟胸腺細胞的凋亡，從而使胸腺細胞數增多，體積增大［9］。那么，E2F1基因敲除對骨髓造血干、祖細胞是否也有影響，目前未見相關研究。本研究應用流式細胞儀分析E2F1基因敲除小鼠的外周血、脾臟、骨髓等組織細胞，了解E2F1基因敲除對上述組織細胞及造血干、祖細胞的作用。

1 材料和方法

1.1 動物與設備

E2F1基因敲除小鼠來自北京協和醫學院比較醫學中心，遺傳背景為129，對照小鼠為同窩野生型小鼠，動物生產及使用許可證號:【SCXK(京)2009-0007;SYXK(京)2011-0022】。主要實驗設備為美國BD公司Aria流式細胞儀。

1.2 PCR方法鑒定E2F1基因敲除小鼠基因型

用10日齡小鼠尾尖提取基因組 DNA，普通PCR鑒定基因型。反應條件:94℃預變性3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環;72℃延伸10 min?；蚯贸∈蟮?PCR鑒定引物:oIMR0580:5'-GGATATGATTCTTGGACTTCTTGG-3'，oIMR0581:5'-CTAAATCTGACCACCAAACGC-3'，oIMR1997:5'-CAAGTG CCAGCGGGGCTGCTA AAG-3'，PCR產物長度，野生型為172 bp，E2F1敲除為227 bp，雜合子同時有上述兩條片段。引物由上海英駿生物工程技術有限公司合成，PCR試劑購自寶生物工程有限公司。

1.3 流式分析

小鼠脫頸椎處死后，取脾臟、后肢骨，置于冰上預冷的染色緩沖液(含1%BSA的PBS)中。脾臟用磨砂玻片研磨成細胞懸液;后肢骨用5 mL注射器將骨髓細胞沖出，并吹打成細胞懸液。將細胞懸液用50 μm尼龍濾膜過濾后收集到15 mL離心管中，用PBS定容至10 mL，混勻后，取10 μL細胞懸液，稀釋10倍后計數細胞數。細胞懸液離心，1 000 r/min，10 min，將細胞濃度調整為1×108個細胞/mL。分別取106細胞標記熒光抗體(BD公司)。

骨髓造血干細胞的分析中用如下抗體進行標記:CD34-FITC、Flt3-PE、CD16/32-Percp-cy5.5、Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Ter-119-biotin、Gr-1-biotin、Mac-1-biotin、B220-biotin、IL-7R-biotin、CD4-biotin、CD8-biotin、biotin-APC-Cy7。骨髓造血干細胞(HSC)表面標記為:lin-c-kit+sca1+，長期造血干細胞(LT-HSC)表面標記為:Lin-c-Kit+Sca1+CD34－Flt3－，短期造血干細胞(ST-HSC)表面標記為:Linc-Kit+Sca1+CD34+Flt3－，髓系祖細胞(MP)表面標記為:Lin-c-Kit+Sca1－，共同髓系祖細胞(CMP)表面標記為:Lin-c-Kit+Sca1－CD34－CD16/32low，粒單系祖細胞(GMP)表面標記為:Lin-c-Kit+Sca1－CD34+CD16/32high，巨核單系祖細胞(MEP)表面標記為:Lin-c-Kit+Sca1－CD34+CD16/32low。IgDFITC、CD43-PE、B220-PE-Cy7、IgM-APC，標記不同發育階段的B淋巴細胞。脾臟及外周血細胞標記抗體:CD4-FITC、 CD8-Percp-cy5.5、 B220-PE-Cy7、CD11B-APC-Cy7。上述抗體加入細胞懸液，冰上避光，30 min;加1 mL 染色緩沖液，離心，2600 r/min，5 min，棄上清液，加200 μL染色緩沖液重懸細胞，用50 μm尼龍濾膜過濾，冰上避光備用。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，各組數據均采用ˉ±s表示。組間資料分析采用t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR鑒定結果

剪取10日齡小鼠腳趾，采用飽和氯化鈉法提取小鼠基因組DNA，進行PCR，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，野生型產物長度為172 bp，E2F1缺失產物長度227 bp。基因型鑒定結果見圖1。

2.2 E2F1基因敲除小鼠骨髓B細胞減少

已有研究發現，與野生型小鼠相比，E2F1基因敲除小鼠的胸腺明顯增大，胸腺細胞總數顯著增多［9］，而對外周血、脾及骨髓等未見相關研究。本研究中亦發現E2F1基因敲除小鼠胸腺明顯增大(圖2A)。我們對E2F1基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠的外周血、脾、骨髓中 B220+、CD4+、CD8+、CD11b+細胞進行流式分析。結果發現，與野生型小鼠相比，E2F1基因敲除小鼠外周血中CD4+細胞顯著增多，而CD11b+細胞顯著減少，骨髓中B220+細胞顯著減少，CD8+細胞顯著增多，脾臟中各種細胞的比例無明顯差異(圖2B、C，脾臟細胞分析圖未顯示)?？梢姡珽2F1基因敲除對造血系統各種細胞均有重要影響。

圖1 E2F1基因敲除小鼠鑒定結果Fig．1 Genotyping of the E2F1 knockout mice

2.3 E2F1基因敲除小鼠髓系祖細胞及前體B細胞減少

CD11b+細胞由髓系祖細胞發育而來，我們分析了髓系祖細胞及各單系祖細胞的變化。結果顯示，E2F1基因敲除后，髓系祖細胞及各單系祖細胞數量均顯著減少(圖3A)。對B細胞發育的流式分析結果發現，前體B細胞及未成熟B細胞均顯著減少，而成熟B細胞的比例顯著增加(圖3B)。這說明E2F1基因對髓系及B細胞發育有重要作用。

2.4 E2F1基因敲除小鼠骨髓造血干細胞減少

圖2 E2F1基因敲除影響外周血及骨髓細胞Fig．2 E2F1 gene knockout influences the cells in the peripheral blood and bone marrow

圖3 E2F1基因敲除影響髓系祖細胞及前體B細胞發育Fig．3 E2F1 knockout influences the development of myeloid progenitor and pre B cells

為了了解E2F1基因對骨髓造血干細胞的影響，我們分析了骨髓造血干細胞及長期、短期造血干細胞數及細胞周期的變化。研究發現，E2F1基因敲除后，骨髓造血干細胞、長期造血干細胞及短期造血干細胞的數量顯著減少，而且處于靜止期的造血干細胞比例明顯降低(圖4)。由此可見，E2F1基因對骨髓造血干細胞發育、分化有重要作用。

3 討論

已有研究表明，E2F1基因缺失可以抑制小鼠胸腺細胞凋亡，從而使成熟T細胞增多、胸腺增生［9］，而關于E2F1基因缺失對造血干細胞的影響，未見相關研究。

圖4 E2F1敲除影響骨髓造血干細胞數量及細胞周期Fig．4 E2F1 knockout influences the number of HSC and cell cycle

本研究應用E2F1基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠，應用流式細胞儀分析E2F1基因缺失對造血系統的影響。研究發現，E2F1基因缺失小鼠，外周血CD4+細胞比例增多，CD11b+細胞比例降低，骨髓中CD8+細胞比例增多，B220+細胞比例降低，可見E2F1基因缺失對造血系統中T、B淋巴細胞及髓系細胞均有重要影響(圖2)。因此，本研究進一步分析了骨髓中前體B淋巴細胞的發育，結果發現，前體B淋巴細胞及未成熟B淋巴細胞比例明顯降低，而成熟B淋巴細胞比例顯著增高，這說明E2F1基因在B淋巴細胞發育中有重要作用(圖3B)。同時，對髓系祖細胞的分析發現，E2F1基因缺失小鼠，髓系祖細胞及各單系祖細胞數明顯減少，可見E2F1基因對髓系細胞的發育有重要作用(圖3A)。另外，本研究發現E2F1基因敲除小鼠中造血干細胞(LSK)及長期造血干細胞(LT-HSC)、短期造血干細胞(STLSK)的數量都明顯減少，而且處于G1期的造血干細胞顯著降低，由此可見，E2F1基因對造血干細胞的細胞周期調節起重要作用(圖4)。

E2F1基因對造血干細胞影響的作用機制，還需進行增殖、凋亡及相關信號通路等實驗;E2F1基因敲除對造血干細胞功能的影響，尚需通過克隆形成、競爭性骨髓移植等實驗進一步研究。

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