CAR菌TaqMan MGB探針法實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立與應用

高正琴，岳秉飛，關偉鴻

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

CAR菌(Cilia-associated respiratory bacillus)與慢性呼吸道疾病(chronic respiratory disease，CRD)的發生密切相關。細菌學檢查主要靠尸檢，通過銀染技術做組織學檢查，在呼吸上皮纖毛中檢出CAR菌可確診，但生前很少能作出診斷［1－2］。迄今為止，國內外尚未見用 TaqMan MGB(groove binder，小溝結合物)探針實時熒光定量 PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)檢測CAR菌的研究報道。本研究利用新一代TaqMan MGB探針技術，建立了一種特異敏感檢測CAR菌的實時熒光定量PCR方法，并成功應用于臨床標本中CAR菌的快速定量檢測。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和菌株來源

TaqMan mix、無核酸酶水(nuclease-free water)購自美國ABI公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、通用型基因組DNA提取試劑盒、dNTP mixture、EX Taq、agarose、DNA ladder marker購自寶生物工程(大連)有限公司。含有 CAR菌 16S rRNA(16S ribosomal RNA，核糖體核糖核酸)基因的陽性對照品由本實驗室保存，標準質粒DNA濃度為2.7×1011拷 貝/μL。 肺 炎 支 原 體 (Mycoplasma pneumoniae)、侵 肺 巴 斯 德 菌 (Pasteurella pneumotropica)、支氣管鮑特桿菌(Bordetella bronchiseptica)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸埃希菌 (Escherichia coli)和肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的DNA由本實驗室保存。

1.2 標本來源和DNA提取

2008～2012年采集動物源性標本1 344份。野生成年樹鼩捕獲自云南昆明野外;灰倉鼠來自新疆自治區;金黃地鼠來自四川成都;小型豬、長爪沙鼠、大鼠、小鼠分別由北京20多家動物養殖中心提供。對于樹鼩、小型豬、灰倉鼠、金黃地鼠、長爪沙鼠、大鼠、小鼠活體采集全血，離心收集血清。小型豬活體采集鼻腔分泌物，安樂死后采集腦、氣管、淋巴結、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸標本。大鼠、小鼠安樂死后采集肺臟、肝臟、腸標本。各種標本總數及收集年份見表1。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取肺炎支原體、侵肺巴斯德菌、支氣管鮑特桿菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎鏈球菌DNA。按通用型基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取野生樹鼩、小型豬、灰倉鼠、金黃地鼠、長爪沙鼠、大鼠、小鼠標本DNA。DNA置于－70℃保存待用。

1.3 CAR菌熒光定量PCR引物和TaqMan探針設計

根據CAR菌16S rRNA基因序列(GenBank登錄號:L11886.1)，經過同源性分析［3～4］，用 Primer Expression 3.0軟件設計引物和探針。正向引物GZQCAR16STF:5'-GGTTCCTCGCGTATCATCGAATT AA-3';反向引物 GZQCAR16STR:5'-ACGATCGC AAGGTTGAAACTCA-3';探針 GZQCAR16STP:FAMCCACATGTTCCACCTCTT-MGB-NFQ。擴增產物片段大小為89 bp。熒光定量PCR引物和TaqMan探針由美國ABI公司合成。

1.4 CAR菌TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR

總反應體系為20 μL，包括正、反向引物(各900 nmol/L)和探針(250 nmol/L)共 1 μL、TaqMan mix 10 μL、模板 DNA 1 μL、nuclease-free water 8 μL。循環參數:95℃ 20 s;95℃ 3 s，60℃ 30 s，共 40個循環。用儀器自帶SDS軟件實時觀察PCR熒光擴增曲線并采集數據。

1.5 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR標準曲線構建

分別取1 μL稀釋后的標準質粒(2.7×100～2.7×1010拷貝/μL)作為模板，同上條件進行TaqMan MGB探針法熒光定量PCR反應。每個稀釋度平行重復3次試驗。將上述標準質粒與其Ct值進行回歸分析，經對數擬合作圖形成標準曲線。根據標準曲線能夠推斷出待測標本中CAR菌的載量。

1.6 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR方法的敏感性試驗

將CAR菌標準質粒(2.7×1011拷貝/μL)作10倍倍比稀釋，分別取1 μL稀釋后的標準質粒(2.7×100～2.7×1010拷貝/μL)為模板，同上條件進行熒光定量PCR反應，檢測建立的熒光定量PCR方法能檢出最小標準質?？截悢?，分析該方法靈敏性。

1.7 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR特異性試驗

以CAR菌標準質粒、肺炎支原體、侵肺巴斯德菌、支氣管鮑特桿菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌核酸和無核酸酶水為模板，同上條件進行熒光定量PCR反應，分析該方法特異性。

1.8 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR重復性和穩定性試驗

將CAR菌標準質粒、TaqMan MGB探針熒光定量PCR引物等反復凍融9次，分別取1 μL稀釋后的標準質粒(2.7×100～2.7×108拷貝/μL)作為模板，同上條件進行TaqMan MGB探針法熒光定量PCR反應。在同1個試驗中，每個稀釋度標準質粒做3個復孔，以分析組內差異。再以相同標準質粒為模板，連續3天進行3次獨立重復試驗，以分析組間差異。通過統計計算Ct(在擴增反應中，當熒光信號增長到大于閾值時所對應的循環數(threshold cycle)相對標準差(relative standard deviation，RSD)驗證該方法的重復性和穩定性。

1.9 CAR菌TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR和普通PCR檢測實際標本

為了評價本研究建立的TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR方法對實際標本檢測的實用性，分別以野生樹鼩、小型豬、灰倉鼠、金黃地鼠、長爪沙鼠、大鼠、小鼠的標本DNA為模板，同上條件進行實時熒光定量PCR反應。

根據 CAR菌16S rRNA基因序列，用 Primer Premier 5.0軟件設計一對 PCR引物，正向引物GZQCAR16SF:5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTTAGC C-3';反向引物 GZQCAR16SR:5'-AGTAGGACTCG GTCCTAGTTTGAGA-3'。預期擴增片段大小1 490 bp。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。分別以野生樹鼩、小型豬、灰倉鼠、金黃地鼠、長爪沙鼠、大鼠、小鼠標本DNA為模板，采用CAR 菌 普 通 PCR 引 物 (GZQCA16SF、GZQCA16SR)、反應體系(5 μL 10 × PCR buffer，4 μL dNTP mixture，正、反向引物各 1 μL，0.25 μL EX Taq DNA 聚 合 酶，5 μL 模 板 DNA，33.75 μL nuclease-free water)和擴增條件(94℃預變性5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30 次循環;最后一次循環后72℃再延伸5 min)進行檢測。反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2 結果

2.1 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR標準曲線構建

將上述標準質粒與其Ct值進行回歸分析，經對數擬合作圖形成標準曲線，回歸方程為y=－3.22x+38.048，斜率為 －3.22，相關系數 R2為0.999，擴增效率為104.432%(圖1)。

圖1 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR標準曲線構建Fig．1 Construction of standard curve of the TaqMan MGB probe-based fluorescence quantitative PCR for detecting cilia-associated respiratory bacillus

2.2 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR敏感性試驗

將CAR菌標準質粒(2.7×1011拷貝/μL)進行10倍連續稀釋，取不同濃度的標準質粒(2.7×100～2.7 ×1010拷貝/μL)各 1 μL 作為樣本，按上述TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR檢測以分析該方法的靈敏度，實驗重復3次。結果顯示，本方法最低可檢測2.7×100拷貝/μL的質粒DNA(圖2)。

2.3 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR特異性試驗

圖2 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR敏感性試驗Fig．2 Results of sensitivity test of the TaqMan MGB probe-based fluorescence quantitative PCR for detecting cilia-associated respiratory bacillus

對CAR菌標準質粒、肺炎支原體、侵肺巴斯德菌、支氣管鮑特桿菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌核酸和無核酸酶水進行 TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR檢測，分析該方法的特異性。結果CAR菌標準質粒出現特異熒光擴增曲線;而肺炎支原體、侵肺巴斯德菌、支氣管鮑特桿菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌和無核酸酶水均未見特異熒光擴增曲線和Ct值升高(圖3)。結果表明本方法特異性為100%。

2.4 TaqMan MGB探針熒光定量PCR重復性和穩定性試驗

將不同拷貝數的CAR菌標準質粒(2.7×100～2.7×109拷貝/μL)、TaqMan MGB 探針熒光定量PCR引物等反復凍融9次，然后連續3天測定3次，同一時間重復測定3孔，計算組內和組間差異。結果顯示，組內RSD為0.30% ～2.31%，組間RSD為0.25% ～4.97%，RSD值均＜5%(表1)。結果證明該方法具有良好的穩定性和重復性。

圖3 CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR特異性試驗結果Fig．3 Results of specificity test of the TaqMan MGB probe-based quantitative PCR assay for detecting cilia-associated respiratory bacillus

表1 CAR菌TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR重復性試驗Tab．1 Results of reproducibility test of the TaqMan MGB probe-based real-time fluorescence quantitative PCR assay for detecting cilia-associated respiratory bacillus

表2 TaqMan MGB探針熒光定量PCR檢測CAR菌Tab．2 Results of the TaqMan MGB probe-based fluorescence quantitative PCR for detection of cilia-associated respiratory bacillus

2.5 CAR菌TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR和普通PCR檢測實際標本

用CAR菌TaqMan MGB探針熒光定量PCR檢測1 344份標本結果可以判定為陽性的標本有510份(表2)。檢出的陽性標本用CAR菌普通PCR能擴增出特異性目的片段。CAR菌陽性樣本核酸序列測定和基因分型研究結果另文報道。

3 討論

目前，國內外還未見有野生樹鼩、小型豬等CAR菌感染的研究報道。GenBank中也未見有CAR菌的全基因組序列公布。本研究采用TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR方法對1 344份臨床標本進行檢測，結果，從野生樹鼩、小型豬、灰倉鼠、長爪沙鼠、金黃地鼠、大鼠、小鼠標本中均檢出了CAR菌，其中小鼠、金黃地鼠、小型豬的CAR菌感染較為嚴重。

CAR菌是一種未分類的、細絲狀、革蘭氏陰性菌。因CAR菌會同其他呼吸道菌或病毒引發呼吸系統疾病，該菌僅在細胞培養或補充胎牛血清細胞培養基中呈滑動性和增長，故常規細菌學檢查陽性率 不 高［5－10］。 間 接 免 疫 熒 光 試 驗 (indirect immunofluorescence assay，IFA)等血清學方法無法對CAR菌的早期感染做出診斷［11］。普通PCR卻存在著操作步驟繁瑣、容易造成污染、難以準確定量檢測等不足。近年來，實時熒光定量PCR技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析、突變和多態性研究、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用。與普通的TaqMan探針比較，MGB探針具有兩大特點:一是探針3'端標記了自身不發光的淬滅分子，以取代常規可發光的TAMRA等熒光標記。這使熒光本底降低，熒光光譜分辨率得以大大改善。二是探針3'端增加了一個MGB。MGB可以穩定探針與模板的雜交，提高探針的退火溫度，一方面縮短了探針長度，使熒光基團和淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好;另一方面，也提高了探針的特異性，使結果更精確，分辨率更高［12］。因此，運用時效性和準確性均比較高的TaqMan MGB探針熒光定量PCR技術階段性的開展CAR菌監測工作，阻斷感染的中間環節，必將有效地預防和控制疾病的發生。

綜上所述，本研究以16S rRNA為靶基因，應用TaqMan MGB探針熒光定量PCR技術，實現了對CAR菌的定量分析，并將此方法首次成功應用于臨床標本中CAR菌的檢測。建立的TaqMan MGB探針熒光定量PCR方法具有準確、可靠、快速檢測的特點，可推廣應用于動物源性產品、生物制品中CAR菌的檢驗、食品藥品安全檢驗、環境監測、流行病學調查等諸多領域，為提高CAR菌的檢出率提供特異有效的評價手段。

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