改良雞胚尿囊膜腫瘤實驗動物模型及其生物學(xué)行為觀察

馬繼偉，張 勇，張逸鎧，李海瑩，馬征來，王 超，夏潮涌，鐘雪云

(1.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣州 510632;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣州 510632)

動物模型是研究疾病發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機制的重要手段，目前常用的體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ蜑槁闶?，而裸鼠模型因其實驗周期長，費用昂貴、實驗條件要求高，限制了它的廣泛應(yīng)用。近年來，雞胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane，CAM)模型在腫瘤血管方面的研究受到關(guān)注。因雞胚發(fā)育的9～14 d，免疫系統(tǒng)并沒有完全形成，排斥反應(yīng)尚未建立，有利于建立各種移植腫瘤模型。相比裸鼠等哺乳動物模型，利用雞胚CAM建立腫瘤模型，建模周期短，便于觀察。腫瘤細胞種植到CAM相對無血管的區(qū)域后3～5 d，肉眼可見腫瘤形成，且生長迅速。國內(nèi)外已有學(xué)者利用雞胚尿囊膜成功建立了前列腺癌［1］、卵巢癌［2］、腎癌［3］及 U87 細胞膠質(zhì)瘤［4］等移植瘤模型。本研究利用改良的實驗技術(shù)建立惡性膠質(zhì)瘤雞胚尿囊膜(CAM)移植腫瘤模型，為后續(xù)開展惡性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為、腫瘤與血管形成關(guān)系、抗腫瘤藥物篩選等研究提供良好的動物實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 材料

SWO-38膠質(zhì)瘤細胞株由暨大醫(yī)學(xué)院病理教研室自行建系，該細胞來源于12歲男性小腦蚓部纖維性星形細胞瘤(WHO膠質(zhì)瘤分類I級)，經(jīng)體外培養(yǎng)生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有惡性星形細胞瘤的特征，主要用于膠質(zhì)瘤生物學(xué)特征的體外研究［5，6］;受精種蛋:(華農(nóng)正大禽業(yè)有限公司);改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司);胎牛血清(天津灝陽公司);胰蛋白酶(Difco公司);甲醛(國產(chǎn)分析純試劑);Olympus體視顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):細胞培養(yǎng)SWO-38細胞于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為改良型RPMI-1640培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)。取處于對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 雞胚孵育:德國伊沙雞種，購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)正大禽業(yè)有限公司，受精種蛋經(jīng)消毒放入于溫度37.0℃，相對濕度60% ～80%的恒溫孵箱中孵育，胚頭斜向上方，雞蛋長軸與蛋托約成45°，每天晾蛋及翻蛋10 min，孵育備用。

1.2.3 細胞接種:取對數(shù)生長期的SWO-38細胞，常規(guī) 0.25%胰酶消化 4 min，1 000 r/min離心 3 min，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)量并分為0.8×106/60 μL，1 ×106/60 μL，2 ×106/60 μL，4 × 106/60 μL，8 ×106/60 μL 和不含細胞的無血清培養(yǎng)基組(對照組)。種蛋46支，共分為6組，參考賀國安等［7］的無氣室孵育法(有改進)。孵育 9 d 后［7］在照蛋器下用鉛筆劃定氣室的范圍，75%酒精常規(guī)消毒，無菌鑷子在劃定氣室范圍內(nèi)先輕輕敲開蛋殼大小約(5×5)mm保留殼膜，用浸濕的PBS棉球輕沾殼膜以吸走蛋殼碎屑，繼續(xù)開口至(1.5×1.5)cm大小，無菌鑷子撕去周圍蛋殼和殼膜，沾有無菌PBS溶液的棉球輕輕濕潤氣室膜，此時可清楚顯現(xiàn)尿囊膜的血管，尖鑷子輕輕劃開氣室膜，切勿損傷其下尿囊膜，揭開氣室膜暴露其下尿囊膜，于大血管之間相對無血管區(qū)放置一內(nèi)徑為0.4 mm的硅膠圈，按照分組每只雞胚滴加不同密度的細胞或不含細胞的無血清培養(yǎng)基60 μL，用無菌透明膠封閉，接種24 h后取出硅膠圈，同時覆蓋(2×2)cm的無菌保鮮膜于開口位置，繼續(xù)用無菌透明膠封閉。每隔24 h在燈下通過窗口觀察雞胚存活及接種區(qū)尿囊膜腫瘤及周圍血管情況。

1.2.4 移植瘤取材:雞胚接種后繼續(xù)孵育5 d，于水下剝離蛋殼和殼膜，完整取下雞胚，置于盛有4%甲醛固定液的皿中，腫瘤取出常規(guī)石蠟包埋，HE染色進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法:本文分類資料采用率表示，多組數(shù)據(jù)之間率的比較采用X2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 接種細胞數(shù)量對存活率及成瘤率的影響

本實驗將SWO-38細胞按細胞數(shù)分成5組分別接種至雞胚尿囊膜，繼續(xù)孵育5 d觀察，結(jié)果顯示各組SWO-38細胞對雞胚存活率并無影響，1×106細胞數(shù)量組存活率略低，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析不同細胞數(shù)量對雞胚存活率的影響差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。如表1所示成瘤率隨細胞數(shù)目的增加而升高，8×106細胞數(shù)量組的成瘤率與對照組及0.8×106組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

表1 不同細胞數(shù)目對雞胚存活率和成瘤率的影響Tab．1 Effect of the number of inoculated glioma cells on the survival rate of chicken embryos and tumor formation rate

2.2 移植瘤誘導(dǎo)血管生成

實驗中觀察到，腫瘤細胞接種24 h內(nèi)腫瘤細胞懸液呈薄膜樣浮于尿囊膜上，血管無特殊改變;48 h內(nèi)腫瘤肉眼可見，并可觀察到較為微弱的血管反應(yīng);72 h腫瘤小團塊形成并牽拉尿囊膜使尿囊膜包裹腫瘤團塊，血管增粗紊亂;至接種后第5天，腫瘤質(zhì)韌、呈魚肉狀，外有尿囊膜包裹，腫瘤誘導(dǎo)血管圍繞腫瘤生長。(圖1，見文后彩插2)

2.3 移植瘤的形態(tài)學(xué)特征

常規(guī)石蠟包埋，HE染色，鏡下見模型瘤體以雞胚尿囊膜為基質(zhì)生長，2×106/60 μL細胞密度腫瘤組織生長較8×106/60 μL細胞密度生長較好(圖2A、B)。局部區(qū)域可見腫瘤細胞遷移至血管周圍(圖2D)，新生血管圍繞腫瘤團塊生長(圖2C)，血供豐富處腫瘤團塊較大，反之腫瘤細胞分布稀疏。腫瘤細胞較密集的地方還可以觀察到腫瘤中心因血供不足而發(fā)生壞死，腫瘤細胞周圍存在炎癥反應(yīng)(圖2E)。腫瘤細胞多呈圓形或橢圓形，體積大，可見瘤巨細胞，胞漿少，核大深染，異型性明顯，病理性核分裂相常見(圖2F)。上述表現(xiàn)均符合惡性腫瘤的組織學(xué)特征(圖2見文后彩插2)。

3 討論

已有學(xué)者利用雞胚尿囊膜模型成功建立宮頸癌［8］、骨肉瘤［9］等移植瘤模型，但均未對其技術(shù)細節(jié)進行探討，本實驗著重對實驗技術(shù)進行改良及優(yōu)缺點進行探討。常見的開窗法是在孵育第7～9天的蛋殼上磨切開窗，本文采用無氣室開窗法，減少了蛋殼碎屑殘留，同時尿囊膜可充分暴露，便于確定加樣位置。有文獻報道利用透明膠封閉后每天通過透明膠觀察雞胚存活及成瘤情況［10］，但是直接用透明膠封閉24 h后，透明膠產(chǎn)生白霧，無法觀察雞胚內(nèi)部情況。故本實驗嘗試先用無菌保鮮膜封閉窗口再以透明膠固定的方法，既避免白霧的產(chǎn)生，又利于直觀觀察雞胚情況。以無氣室開窗法結(jié)合無菌保鮮膜封閉窗口，保證了雞胚存活率的穩(wěn)定，同時利于后續(xù)實驗觀察。尿囊膜的藥物及移植瘤實驗中，常用載體為濾紙、甲基纖維素、明膠海綿或者直接滴加，本實驗采用內(nèi)徑為0.4 mm的硅膠圈放置于大血管間的相對無血管區(qū)，利于腫瘤細胞懸液聚集在一定范圍內(nèi)不致彌散。膠圈雖然可以很好的聚集腫瘤細胞但是因其對血管有損傷故于接種后24 h取出膠圈。雖然上述三點可以保證尿囊膜移植瘤模型成功建立，但是該模型若要開展后續(xù)研究仍存在著其自身的不足。該模型若作為抗腫瘤藥物篩選模型給藥方式只能滴加給藥或靜脈注射給藥，相反裸鼠模型可以實現(xiàn)多種方式給藥最大可能地模擬人體的給藥方式，更為精確地得完成藥物抗腫瘤作用的評價;文獻報道利用U87［11］膠質(zhì)瘤細胞株和SWO-38［6］細胞株建立裸鼠模型所需細胞數(shù)均在2×106/只以下，而建立相應(yīng)的尿囊膜移植瘤模型至少需要(5～8)×106/只，其他類型腫瘤的移植瘤所需的細胞數(shù)量標準不一，差異較大，細胞數(shù)1×105～1×1012/只不等［2］，使得不同實驗室只能根據(jù)自身的條件探索合適的細胞數(shù)量，因此一定程度地消弱了此模型的價值。

本研究重點觀察了不同細胞數(shù)目對雞胚存活、成瘤的影響及腫瘤組織與血管生成的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn):不同細胞數(shù)目對雞胚存活率無影響，且隨著接種細胞數(shù)目的增加雞胚成瘤率也在增加，但是實驗中觀察到細胞密度2×106/60 μL組較之細胞密度8×106/60 μL組腫瘤整體生長好，能很好的觀察到腫瘤組織在尿囊膜的生物學(xué)行為，但是成瘤率較低。因此建立雞胚尿囊膜移植瘤模型需根據(jù)細胞株及實驗?zāi)康模剿骱线m的細胞密度，保證成瘤率同時又能較好觀察其相關(guān)生物學(xué)行為。細胞數(shù)目過少成瘤率較低不利于實驗開展，細胞數(shù)過多，造成腫瘤區(qū)域營養(yǎng)不足，影響腫瘤生長。因此本實驗綜合此兩種因素認為4×106/60 μL為合適細胞密度。腫瘤組織生長與血液供應(yīng)關(guān)系密切［12］，通過對尿囊膜上移植瘤的連續(xù)動態(tài)觀察，觀察到尿囊膜血管較接種之前有所增加，尿囊膜血管圍繞腫瘤組織生長。同時通過組織學(xué)也發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞體積較大，核大深染，病理性核分裂相十分易見，腫瘤組織周圍血液供應(yīng)豐富，同時血運貧乏處腫瘤分布稀疏，符合惡性腫瘤的細胞形態(tài)及腫瘤組織生長特征，因此本實驗為研究惡性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為尤其是腫瘤與血管生成的關(guān)系建立了一個良好的模型。

與裸鼠移植瘤模型相比，尿囊膜模型更能直觀的觀察腫瘤的發(fā)生、發(fā)展變化過程，且可以簡單明了的觀察到腫瘤與血管的關(guān)系，有研究預(yù)先通過siRNA干擾技術(shù)將膠質(zhì)瘤U87細胞下調(diào)VEGF表達后，接種至尿囊膜觀察到低表達VEGF的移植瘤的新生血管明顯減少，腫瘤細胞密度也下降［13］，對U87膠質(zhì)瘤尿囊膜移植瘤應(yīng)用抗癌藥物也得到類似結(jié)果［14］，說明尿囊膜移植瘤模型在觀察腫瘤生長規(guī)律、抗腫瘤藥物篩選尤其是抗血管相關(guān)藥物篩選具有應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

通過改良的方法對9日齡雞胚的尿囊膜進行膠質(zhì)瘤細胞接種，成功建立了膠質(zhì)瘤的雞胚移植瘤模型，該模型相較于裸鼠等其他模型具有實驗周期短、成本廉價等優(yōu)點，同時該模型能較好地觀察腫瘤的生物學(xué)行為，為后期建立抗腫瘤藥物篩選模型提供了良好的平臺。

［1］ Kunzi-Rapp K，Genze F，Küfer R，et al．Chorioallantoic membrane assay:vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model［J］．J Urol，2001，166(4):1502 －1507．

［2］ 楊麗華，王凱峰，周軼鐵，等．人卵巢癌雞胚尿囊膜血管生成模型的建立［J］．現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2003，12(6):407－409．

［3］ 張斌，阮喜云，陳杰，等．人腎癌雞胚模型的建立及其腫瘤生物學(xué)特性的研究［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版)，2012，33(1):68－70．

［4］ Strojnik T，Kavalar R，Barone TA，et al．．Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains［J］．Anticancer Res，2010，30(12):4851 －4860．

［5］ Zhong XY，Chen YX，Ye SF，et al．Establishment of two cell sublines from SWO-38 glioma cell:immunohistoimmunal and ultrastructural study［J］．Int J Modern Cancer Ther，2000，3(2):34－36．

［6］ 司徒銳，王慧華，王錦環(huán)，等．人腦惡性膠質(zhì)瘤體外細胞系SWO-38的建立和生物學(xué)特征［J］．癌癥，1987，6(4):235－238．

［7］ 賀國安，羅進賢，張?zhí)碓龋倪M的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)-無氣室孵育法［J］．中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，42(2):126－128．

［8］ 湯球，崔淑芳，蔡麗萍，等．雞胚宮頸癌模型的建立及其生物學(xué)特性［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(10):19－22．

［9］ Wang JP，Wang LH，Cai L．Establishment of a transplantation tumor model of human osteosarcoma in chick embryo［J］．Chin-Germ J Clin Oncol，2009，8(9):531 －536．

［10］ 于文靜，趙靜，連波，等．人大腸癌雞胚尿囊膜移植模型的建立及血管生成特征的觀察［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(3):32－35．

［11］ 張治業(yè)．蜈蚣藻多糖對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞及其裸鼠移植瘤生長的抑制作用［J］．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，36(9):1051－1053．

［12］ Hanahan D，Weinberg RA．Hallmarks of cancer:the next generation［J］．Cell，2011，144(5):646 －674．

［13］ Hagedorn M，Javerzat S，Gilges D，et al．Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model［J］．PNAS 2005，102(5):1643 －1648．

［14］ Hagedorn M，Zilberberg L，Wilting J，et al．Domain swapping in a COOH-terminal fragment of platelet factor 4 generates potent angiogenesis inhibitors［J］．Cancer Res，2002，4(2):6884－6890．