胚胎發育早期神經上皮的顯微移植技巧及應用

白仲添，嚴 俊，孟文勃，張 磊，周文策，李 汛

(1．蘭州大學第一醫院普外二科，甘肅省肝膽胰外科研究所，蘭州大學臨床醫學院腫瘤防治中心，甘肅蘭州 730000;2．Department of Neuroanatomy，Institute of Anatomy，University of Bonn．Germany 53115 Bonn)

脊椎動物的頭部運動神經元的胞體位于腦干， 其軸突通過腦神經的遷移，支配頭頸部肌肉的運動［1］。而且，來自于雞、小鼠或人類等羊膜動物胚胎的神經嵴細胞(neural crest cells，NCCs)越來越成為人們研究動物組織器官命運決定的焦點［2］。發育早期，頭部神經管發生一系列卷曲，發育為前腦、中腦和后腦。尾端神經元保持狹窄并拉長，形成脊髓。運動神經元向腹側分化并形成于基板。頭側的運動神經元軸突在腦干依據背-腹側路線遷移，其軸向位置穿過出口點(exit point)到達周圍的眼肌、舌肌、鰓弓或副交感神經節［3］。盡管近年來人們從分子生物學角度發現了許多支配運動神經元遷移的吸引性或排斥性信號分子，但是運動神經元軸突在神經管內遷移、尋找出口點以及最終到達靶位的每一個階段，是哪些因子在其遷移和軸突尋路中起關鍵作用，目前仍然是研究的焦點［4］。神經嵴細胞是脊椎動物最為關注和重要的祖細胞，其在組織衍生中有非常寬泛的衍生能力。而且其中一些衍生物在成年組織中持久存在，并保持著祖細胞的一些多能性特征［5］。而且，神經嵴細胞還可以衍生為腫瘤細胞，而且，異常的啟動子甲基化在這類細胞中普遍存在［6］，因此，神經嵴細胞的衍生，遷移及軸突導向的功能為腫瘤生物標記物的研究開辟了一條新的途徑。目前對于神經嵴細胞的遷移及分化特性的了解，有很多分子生物學的解釋。但是，內在和外在的影響如何隨著時間的推移，引導它們在空間上適當分化?什么因素調節著神經嵴細胞多能性的維持?在多種疾病中，神經嵴細胞能否應用于細胞替代治療，以影響神經嵴細胞來源組織的增殖和發育?他們能否應用于組織工程?這些問題都有待于進一步研究。近年來，涌現出了許多研究胚胎發育和軸突尋路、神經嵴細胞遷移的發育生物學研究方法，包括免疫化學染色、神經染料逆行跟蹤、病毒示蹤、神經上皮移植等多種方法［7］，但每一種方法都存在許多缺陷，需要在研究中不斷的更新并走向成熟。

顯微移植技術是制備轉基因動物、動物克隆和嵌合體動物制作的必備方法之一［7－10］。在動物克隆研究中，顯微手術對克隆是否成功具有重要的意義。同樣，在胚胎發育早期的神經上皮移植及神經嵴細胞的移植中，胚胎的前期處理、顯微移植針及吸管的制備或操作方法對移植的成功起到關鍵的作用。本文結合我們實驗室多年來的顯微移植經驗，將神經上皮及神經嵴細胞移植的方法，包括胚胎前期處理、顯微針及毛細吸管的制備，嵌合體的制備、神經上皮的移植，神經管、神經嵴細胞及體節等移植的操作方法、技巧及注意事項介紹如下。

1 實驗材料制備

1.1 顯微操作針的制備

顯微操作針由鎢針、毛細玻璃管構成。將尖端口徑為2 mm的薄壁毛細玻璃管在酒精燈上拉制，使得管腔比鎢絲直徑稍大，將3 cm左右長度的鎢絲插入毛細管管腔(插入深度為0.5～0.8 cm為宜)，將毛細管管口在酒精燈下煅燒，使得玻璃融化，以完全固定鎢絲。市場購買12 V、3 A交流變壓器一個，利用絕緣導線將負極插入裝有電解液的杯底(電解液配方見附件)，將正極與暴露于玻璃管的根部鎢絲接觸，并緩緩插入電解液并緩緩提起數次，直到鎢絲變細到針尖肉眼不可及為止。將鎢針倒放在不可觸及的干凈地方備用。

1.2 毛細吸管的制備

毛細吸管主要由毛細管和套在末端的長40 cm左右的橡皮吸管構成。將上述的毛細玻璃管在酒精燈下手工拉制成管腔適合的吸管備用(毛細吸管的粗細由拉針速度決定)。也可用拉針儀制備合適形狀的玻璃吸管。根據移植組織的大小選擇合適的玻璃吸管。

1.3 染色棒的制備

染色棒主要用于早期胚胎移植塊(神經上皮、神經嵴細胞或體節)的染色，便于觀察。將適度拉長的玻璃管在酒精燈上煅燒，使玻璃管尖端融化成表面圓潤光滑、直徑1～2 cm的玻璃球。將染色棒的球端浸在提前配好的Nile blue溶液染液中2～3次，染液剛好沒過玻璃球為宜，使染料充分粘在玻璃球上，晾干備用。

Nile blue溶液制備:0.25 g瓊脂糖溶于10 mL雙蒸水中。然后加入0.1 g Nile blue充分攪拌使其溶解。用前端形成直徑1 mm小球的玻璃管反復沾取溶液使小球沾滿帶有Nile blue的瓊脂糖并常溫晾干備用。

2 實驗方法

2.1 胚胎的前處理

本文以雞胚為例，說明顯微移植的操作方法。胚胎發育分期嚴格按照HH標準［11］。

Locker溶液配制:母液 A:94.270 g NaCl溶于1 000 mL雙蒸水;母液 B:12.0253 g KCl溶于1 000 mL雙蒸水;母液C:15.8092 g CaCl2*H2O溶于1 000 mL雙蒸水;100 mL A+37 mL B+21 mL C+0.03 g青霉素，然后加雙蒸水至1 000 mL，高溫高壓滅菌后備用。

將孵化到預定時期的受精雞蛋在照蛋器上尋找胚胎(早期胚胎呈圓形黑點)，并用鉛筆在雞蛋上劃出胚胎的位置，為了觀察方便，最好選用白皮雞蛋。將雞蛋平放在小托盤上，胚胎軸心垂直于地面朝上。用尖形鑷子輕輕在氣室部扎一小孔，用鋸齒為1～1.5 mm的鋸條與胚胎面呈20～30度角輕輕摩擦蛋殼，開取與黑點大小相當的正方形窗口，用眼科鑷子小心撕開卵殼膜，用吸管小心滴加Locker液，直至胚胎浮于窗口，并繼續加液使窗口形成一凸起的水球(凸面水球起放大鏡的作用)，反復調試光源位置直至反射出白色胚胎。

顯微移植種類主要分為同位移植和異位移植，兩種移植都可用于嵌合體動物模型中。同位移植指將供體胚胎的切取片段移植于受體胚胎的同一部位。異位移植指將供體胚胎的切取部位移植于受體胚胎的不同部位。在雞胚或鵪鶉胚胎的早期發育中，如HH8-13期，神經管經歷開放到閉合的過程。神經管上1/3段主要分布軸突出口(exit point)，在神經管背側，散在分布大量的神經嵴細胞［12］。在這一時期，神經元胞體主要位于神經管下1/3段。體節1～3段的神經管后來主要發育為第三、第五、第七對腦神經;體節4～7段的神經管后來主要發育為第九、第十、十一對腦神經;體節8段以后主要發育為脊神經［13－14］。手術操作一般為一側神經管，另外一側神經管可做對照組(圖1)。

2.2 神經元胞體移植

2.2.1 受體胚胎處理:體示顯微鏡下，在需要移植的部位沿背中線小心切開神經管(切口不要太大，以防移植片段滑落)，用顯微切割針沿神經管下2/3段位置小心切下腹側神經管。等待移植。

2.2.2 供體胚胎處理:沿背中線切開神經管使其呈開口狀。選擇合適大小的染料棒小心涂抹供體移植部位的下1/3段神經管使其染色。用顯微切割針沿軸向小心切除移植部位上2/3神經管。沿垂直于縱軸的方向剝離開下1/3段神經管最后沿基板方向切下神經管，尤其注意在切的過程中，注意標記方向，可用染料深淺標記，也可用切片的形狀標記(圖2)。

從供體胚胎切下的片段吸入毛細吸管，輕輕吹入受體胚胎表面，調整方向，用顯微切割針輕輕夾入受體切開的部位。用5 mL注射器從氣室開口處緩慢吸取蛋清使胚胎下陷1～1.5 cm，用透氣無菌膠布封口，放入孵化箱孵化到預定時期。將孵化后的胚胎從孵化箱中取出，用眼科剪刀從窗口剪開拇指大小的窗口，剪開卵黃膜，用直徑1 cm的漏勺將胚胎取出，放入Locker液中清洗，做后續實驗。

圖1 神經管解剖示意圖Fig．1 Schematic diagram of the neural tube anatomy

圖2 胚胎發育早期運動神經元胞體移植示意圖Fig．2 Schematic diagram of the transplantation of motor neurons at early embryonic development

2.3 神經管移植

神經管移植主要用于腦運動神經軸突尋路的標記。將鵪鶉胚胎神經管移植入雞胚，在后續實驗中，用鵪鶉特異性抗體QCPN染色，可顯示嵌合體中該段神經管內運動神經軸突的遷移軌跡。如將分布第XI對腦神經的神經管移植入分布脊神經的神經管處，由于第XI對腦神經副神經的遷移特性，其在脊神經部位形成一個副神經的特異性軸突運動軌跡(圖3)。

圖3 神經管異位移植示意圖Fig．3 Schematic diagram of hetero-transplantation of the neural tube

2.4 神經嵴細胞移植

調節神經嵴細胞遷移的內外調節因子的研究目前已有很多文獻報道。神經嵴細胞是羊膜動物最為重要的祖細胞，其具有非常廣泛的衍生能力。而且其中一些衍生物在成年組織中持久存在，并保持著祖細胞的一些多能性特征。近年來神經干細胞在腫瘤生物治療中的作用越來越受到人們的重視，Etchevers最先在Nature Protocol上發表了關于神經嵴細胞體外原代培養的文章。因此，神經嵴細胞的體外擴增和臨床應用會越來越多的受到人們的關注。神經嵴細胞的取樣和顯微移植，對于中樞神經系統及器官發育及其神經調節，以及臨床治療都具有重要的意義。

3 顯微移植的問題與展望

顯微移植是一項需要較強的耐心和細致心。在移植過程中，每一個環節都起著至關重要的作用，包括操作針的粗細、吸管管口的平整度、蛋殼窗口的大小、胚胎時期的確定、移植片段的方向等等。只要在操作中多思考，多練習，并嚴格按照成熟的方法操作，一定會取得理想的移植效果。

自上世紀末以來，在運動神經軸突尋路、神經嵴細胞的產生、遷移及其作用的研究中，除了基因敲除和基因沉默技術等技術的應用外，胚胎早期發育的神經組織移植以及神經嵴細胞的切除發揮了開辟性的作用。最近，又攻克了神經嵴細胞的體外培養。對頭運動神經軸突導向，特別是頭-尾、背-腹特異性因子如何調節運動神經元特異性等方面，取得了突破性進展。但是，各種吸引性或排斥性信號分子并不是單一作用于軸突尋路或神經嵴細胞遷移的，而是多種內外因子相互作用的結果。因此，對于各種物理、化學因子的聯合作用研究，仍然需要完善。這就需要在發育早期，將顯微手術、基因敲除、電轉、乃至于干細胞體外培養等聯合起來進行研究，最終將闡明的腦神經的特異遺傳結構，信號通路及尋路策略等應用于臨床，比如腦神經癱瘓、運動神經元疾病及腫瘤［15］。

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