益生菌 L.Casei Zhang對大鼠急性肝損傷的保護作用及其對 TLR4-ERK-PPAR-γ通路的影響①

謝基明 王玉珍 張 威 云小樂 鞏 培 劉竟然 趙世敏 康鴻斌 張和平

(內蒙古自治區人民醫院檢驗科，呼和浩特010010)

益生菌是指那些活的、在攝入一定數量后對宿主有益的微生物［1］。有研究表明，一些益生菌在預防和治療腸道病原菌感染方面積極有效［2，3］。特別地，植物乳酸菌K68可以顯著抑制脂多糖(LPS)誘導的腫瘤壞死因子 α(TNF-α)和前列腺素 E2(PGE2)的表達，從而保護葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠潰瘍性結腸炎［4］。因為肝腸軸的存在，通過服用益生菌來預防肝臟疾病得到越來越多的關注。已經有研究報道顯示，益生菌對于因飲酒、病毒感染以及代謝性疾病引起的慢性肝損傷有保護作用［5，6］。最近的研究表明，口服乳酸菌、雙歧桿菌和藍莓可以減輕LPS和D-氨基半乳糖(D-GalN)誘導的急性肝損傷。另外一項研究表明，植物乳酸菌與L-精氨酸聯合使用可以保護內毒素誘導的肝損傷［7］。然而其中機制尚不明確。

Lactobacillus Casei Zhang(L.Casei Zhang)是從馬奶酒中分離到的一株新的乳酸菌。該菌表現出良好益生菌的特性，如耐酸、耐膽汁、能夠在胃腸道定植［8］。我們以前的體內實驗表明，L.Casei Zhang能夠促進小鼠分泌 IgA和 IFN-γ［9］。在本實驗中，本實驗中以LPS/D-GalN腹腔注射建立大鼠肝損傷模型，研究L.Casei Zhang對急性肝損傷的保護作用研究。進一步地，我們探索了L.Casei Zhang發揮保肝作用的分子機制。本研究為開發益生菌 L.Casei Zhang的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 LPS(O55:B5)和 D-GalN購自Sigma公司。TLR4、p-ERK抗體購自Cell Signaling公司。PPAR-γ和actin抗體購自 Santa Cruz公司。TNF-α酶聯免疫(ELISA)試劑盒購自R＆D公司。反轉錄試劑盒和Taq酶，購自大連寶生物公司。NO測定試劑盒為南京建成生物公司產品。

1.2 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠，體重120～140 g，購自北京維通利華實驗動物公司。22℃恒溫房內飼養，標準顆粒混合飼料(由內蒙古大學動物中心提供)喂養，自由飲水。購買動物適應1周后開始實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組與給藥 48只Wistar大鼠隨機分為4組:對照組(CTRL)，模型組(L/G)，益生菌組(L/G+LCZ)，地塞米松組(L/G+DXM)。通過腹腔注射 LPS(50 μg/ml)與D-GalN(300 mg/kg)建立急性肝損傷模型。益生菌組在建模前30天每日每只大鼠灌服1×109CFU益生菌L.Casei Zhang。地塞米松組在造模前腹腔注射地塞米松(10 mg/kg)。

1.3.2 標本采集 造模后16小時處死大鼠，切開腹部，下腔靜脈取血，切取肝臟右葉4%多聚甲醛固定。其余肝臟液氮凍存。

1.3.3 組織病理學分析 多聚甲醛固定肝臟組織48小時后，進行石蠟包埋、切片、HE染色。采用盲法由病理醫生觀察組織病理學變化。

1.3.4 免疫組織化學染色 石蠟切片(5 μm)經常規脫蠟水化后，用免疫組織化學SP法測定實驗動物肝臟組織中TLR4和p-ERK的表達水平。TLR4工作濃度為1∶50，p-ERK工作濃度為 1∶100。SP試劑盒購自福建邁新生物技術公司。具體操作方法參照SP免疫組織化學試劑盒。

1.3.5 PPAR-γ 表達的檢測 采用TRIZOL法提取肝臟組織的總RNA。RNA完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測OD260和OD280的吸光度，計算RNA的濃度。1 μg RNA反轉錄cDNA。以sence 5'-GGAAGCCCTTTGGTGACTTTATGG-3'和antisence 5'-GCAGCAGGTTGTCTTGGATGTC-3'為 PPAR-γ 引物;以 sence 5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'和 antisence 5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'為GAPDH引物做PCR。肝臟組織中PPAR-γ蛋白的表達采用Western blot方法，具體方法參見文獻［10］。

1.3.6 其他檢測指標 (1)ALT和AST。血液離心后收集血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中ALT和AST水平。(2)TNF-α。肝臟組織勻漿后，采用ELISA試劑盒檢測勻漿上清中TNF-α的表達水平。(3)NO。采用NO測定試劑盒檢測肝臟勻漿上清中NO的表達水平。

1.4 統計學分析 應用 SPSS17.0軟件進行ANOVA分析，P＜0.05時認為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 L.Casei Zhang對急性肝損傷大鼠血清ALT和AST以及肝臟中TNF-α和NO表達的影響 從表1可以看出，與對照組相比，腹腔注射LPS與D-GalN后血清ALT和AST水平顯著增高(P＜0.01)，說明急性肝損傷造模成功。與模型組相比，益生菌組和地塞米松組的ALT和AST水平顯著降低。檢測肝臟組織中炎性因子TNF-α和NO也發現，益生菌組與地塞米松組肝臟中TNF-α和NO表達水平與模型組相比也顯著降低(P＜0.01)。

2.2 L.Casei Zhang減輕急性肝損傷大鼠肝臟病變由圖1可以看出，對照組(CTL)大鼠肝臟組織正常，肝小葉結構可辨，肝索排列整齊;模型組(L/G)的大鼠肝臟肝索排列紊亂，出現肝細胞壞死灶。益生菌治療組(L/G+LCZ)僅出現部分肝細胞壞死，而且肝臟出現巨噬細胞增生性結節，表明益生菌有促進肝臟修復的功能。地塞米松組(L/G+DXM)大鼠的肝臟細胞質均勻，個別區域有細胞壞死灶。

表1 L.Casei Zhang對急性肝損傷大鼠ALT、AST、TNF-α和NO表達的影響Tab.1 Effects of L.Casei Zhang on the expression of ALT，AST，TNF-α and NO

圖1 肝臟切片HE染色的病理學改變(×400)Fig.1 Histological alteration of hematoxylin-eosin-stained liver sections(×400)

2.3 L.Casei Zhang對急性肝損傷大鼠肝臟TLR4表達的影響 為了進一步探索益生菌 L.Casei Zhang保護急性肝損傷大鼠的機制，我們檢測了實驗各組大鼠肝臟組織中TLR4的表達水平。從圖2可以看出，模型組(L/G)TLR4的表達水平顯著高于對照組(CTRL)。益生菌和地塞米松處理后，TLR4的表達水平顯著下降，表明益生菌以及地塞米松保護大鼠急性肝損傷與下調TLR4的表達有關。

2.4 L.Casei Zhang對急性肝損傷大鼠肝臟p-ERK表達的影響 鑒于TLR4信號通路活化后會活化下游的MAPK通路，我們隨后檢測了MAPK通路中的ERK的磷酸化水平。從圖3可以看出，與TLR4的表達增高相一致，模型組(L/G)的p-ERK表達水平明顯增高。與模型組相比，益生菌組(L/G+LCZ)和地塞米松(L/G+DXM)的p-ERK表達顯著降低，表明益生菌和地塞米松發揮保肝作用與降低ERK的磷酸化水平有關。

圖2 L.Casei Zhang降低急性肝損傷大鼠肝臟TLR4的表達(×400)Fig.2 L.Casei Zhang reduced the hepatic TLR4 expression in rats with acute liver injury(×400)

圖3 L.Casei Zhang降低急性肝損傷大鼠肝臟平p-ERK的表達(×200)Fig.3 L.Casei Zhang reduced the hepatic p-ERK expression in rats with acute liver injury(×200)

2.5 L.Casei Zhang對急性肝損傷大鼠肝臟PPAR-γ表達的影響 我們檢測了肝臟組織中PPAR-γ的表達水平。與TLR4和p-ERK的表達增高相反，LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷大鼠肝臟的PPAR-γ的mRNA與蛋白水平都顯著降低。在益生菌與地塞米松處理后，PPAR-γ的mRNA和蛋白表達有所恢復，表明益生菌與地塞米松通過上調PPAR-γ的表達發揮抗炎作用。

圖4 L.Casei Zhang上調急性肝損傷大鼠肝臟平PPAR-γ的表達Fig.4 L.Casei Zhang up-regulates PPAR-γ expression in rats with acute liver injury

3 討論

LPS聯合D-GalN誘導的急性肝損傷模型是一種非常理想的動物模型，因為該模型與由內毒素血癥以及敗血癥誘發的肝炎的臨床表現非常相似。在該動物模型中，由于血液中LPS的存在，導致機體的天然免疫應答系統被過度活化，從而產生過量的前炎癥因子，加速了肝損傷進程。在LPS誘發的前炎性因子中，TNF-α與肝細胞的壞死以及肝衰竭的發生密切相關［11］。此外，LPS/D-GalN誘導產生的活性氧也是急性肝衰竭病因之一［12］。因此有效控制TNF-α以及活性氧的產生是預防以及治療急性肝損傷的有效措施。我們的研究表明，L.Casei Zhang能保護LPS/D-GalN誘導的肝損傷，表現為降低血清中ALT和AST水平，以及降低肝臟TNF-α和NO的表達。在組織病理學水平我們也證實，L.Casei Zhang顯著改善了肝臟的病理損傷。在本實驗中，地塞米松作為陽性對照藥物來治療急性肝損傷。盡管L.Casei Zhang的保護作用不及地塞米松，但是，本實驗中采用的大劑量的地塞米松(10 mg/kg)會引起嚴重的副作用。因此，益生菌L.Casei Zhang具有潛在的保肝作用，有待于進一步開發。

在我們的實驗中，我們著重探討了益生菌L.Casei Zhang發揮保肝作用的機制。我們檢測了肝臟組織中TLR4以及TLR4信號通路的變化。以前的研究表明，TLR4信號通路在肝損傷病理過程中發揮重要作用［13］。此外，在LPS/D-GalN誘導的肝損傷過程中TLR4的表達水平增高［14］。我們的研究結果與該結果一致。然而，在益生菌組以及地塞米松組TLR4的表達水平顯著下調。與此結果一致的是，TLR4下游信號通路中的ERK通路中，ERK的磷酸化水平也顯著降低，表明益生菌L.Casei Zhang是通過調節TLR4信號通路來發揮保肝作用的。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核內受體。亞家族之一的PPAR-γ可以在多個水平調控細胞內多條炎癥信號轉導途徑。其中，PPAR-γ對轉錄因子NF-κB的抑制作用是其發揮抗炎效應的分子基礎［15］。我們的研究表明，在LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷過程中，PPAR-γ的表達下調。然而益生菌和地塞米松作用后，PPAR-γ和表達水平有所上調。益生菌L.Casei Zhang能夠促進PPAR-γ的表達是本文的新發現，對于闡明其作用機理提供了新的線索。

總之，我們的結果顯示，益生菌 L.Casei Zhang對LPS/D-GalN誘導的肝損傷作用有保護作用。這種保護作用與下調TLR4以及TLR4信號通路、與上調PPAR-γ的表達有關。該實驗結果表明，益生菌L.Casei Zhang對于肝臟感染性疾病有潛在的預防作用。

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